论文部分内容阅读
背景肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。国际癌症研究中（International Agency for Research on Cancer，IARC）最新发布的2014年《世界癌症报告》中指出，2012年全球罹患癌症的1410万人中，肺癌患者高达180万并导致159万人死亡，给人类健康带来极大危害。热休克蛋白70（Heat shockprotein70，HSP70）是机体受到应激刺激后产生的一类高度保守的蛋白质，参与调控细胞内蛋白的折叠、保护细胞免受应激损伤等过程。研究发现，HSP70在肺癌组织中的表达量高于正常组织。c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminalkinase，JNK）是促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）超家族的成员之一，应激刺激能够促使其激活并参与细胞凋亡。研究证实，诱导产生的HSP70能够通过影响JNK的活化水平来抑制细胞凋亡。该课题利用小干扰RNA（Small interference RNA，siRNA）下调A549细胞HSP70的表达，观察细胞的增殖活性和凋亡率的变化，检测HSP70、p-JNK和活化型Caspase-3的表达量，探讨HSP70在A549细胞增殖与凋亡中的作用机制。方法1实验方法1.1siRNA的筛选：设置Mock组、NC组、HSP70-1586组、HSP70-2009组和HSP70-2280组，其中Mock组只加转染试剂，NC组转染NC-siRNA，其余3组分别转染HSPA1A-1586、HSP70-2009和HSPA1A-2280。24h后，进行RT-PCR和Real-Time PCR，筛选出沉默效果最好的siRNA。1.2HSP70表达下调对A549细胞的影响：分别设置Mock组、NC组和实验组。其中实验组用筛选出的沉默效果最好的siRNA转染细胞。1.2.1细胞增殖活性检测：转染12h后进行MTT实验，分别在转染后12h、24h、36h和48h检测OD492。1.2.2Western blot：转染48h后，收集细胞并提取蛋白，进行Western blot实验，以β-actin作为内参，用Quantity One软件分析蛋白的相对表达量。1.2.3细胞凋亡率的检测：转染48h后，将细胞消化下来制成单细胞悬液，用Annexin-V-FITC和PI处理细胞，用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。2统计方法：采用SPSS21.0对数据进行统计学分析，均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法或Dunnett法。检验水准α=0.05。结果1siRNA对HSPA1A mRNA的干扰效果：HSPA1A-2009对HSPA1A mRNA的抑制效果最好。2HSP70表达下调对A549细胞增殖活性的影响：与Mock组相比，转染后24h、36h和48h，HSPA1A-2009组细胞增殖活性均下降（均P＜0.05）。3Western blot：HSPA1A-2009组HSP70表达水平低于Mock组和NC组（均P＜0.05）。HSPA1A-2009组的p-JNK表达量低于Mock组和NC组（均P＜0.05）。HSPA1A-2009组活化型Caspase-3表达量低于Mock组和NC组（均P＜0.05），NC组活化型Caspase-3表达量高于Mock组（P＜0.05）。4HSP70表达下调对A549细胞凋亡率的影响：HSPA1A-2009组细胞凋亡率高于NC组和Mock组（均P＜0.05）。结论siRNA-HSPA1A-2009能够有效抑制A549细胞HSPA1A mRNA的表达；siRNA下调HSP70能够抑制A549细胞的增殖，并促进细胞凋亡，且该过程伴随着JNK和Caspase-3活化水平的降低。