白及内生细菌的多样性及内生细菌BSR2010的次级代谢产物分析

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兰科植物白及(Bletilla striata),具有良好的药用价值和开发前景。近年来,由于在制药、医疗、美容等领域的广泛应用,国内外对白及的需求迅速增加,致使野生白及被过度开采,导致其野生资源短缺。植物内生菌是具有高度多样性的微生物资源,生活在健康植物的组织、器官内以及细胞和细胞间隙内而不引起植物病变。其具有促进宿主抵御病原菌和外界条件的胁迫等作用。在长期的进化过程中,由于基因交流,植物内生菌能够产生与宿主植物相同、相似或新型的活性次级代谢产物。迄今为止,大量的植物内生菌产生的代谢产物被分离得到,且被广泛运用在医药和农业等方面,具有巨大的开发潜能,可弥补药用野生资源匮乏的现状。本研究以云南丽江地区种植的白及为研究对象,采用高通量测序技术分别对白及的须根、块茎、茎、叶4种组织的总内生细菌的多样性和功能特征进行分析。通过传统微生物分离培养的方法,获得了1株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、胡萝卜果胶杆菌4种致病菌都有显著抑制作用的内生细菌BSR2010,并用单因素试验对其培养条件进行优化,进一步采用TLC、HPLC、NMR等方法研究其代谢产物。(1)采用高通量测序技术对云南丽江种植的白及须根、块茎、茎、叶4个组织中总内生细菌的多样性进行分析。结果显示,共获得1168652条有效序列,被归属到30个门、79个纲、194个目、369个科、893个属。拟杆菌属、葡萄球菌属等为主要的优势属。菌落多样性表现为:须根>块茎>茎>叶,且4种组织间的总内生细菌菌群的组成、丰度、功能差异性较大。(2)使用传统的微生物分离纯化方法从白及的块茎部分进行内生细菌的分离纯培养,最终得到204株内生细菌,对内生细菌的代谢产物进行抑菌活性筛选,得到1株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、胡萝卜果胶杆菌都具有抑制作用的菌株BSR2010,经16S rDNA初步鉴定为假单胞菌属(Pseudmonas)。利用PCR扩增技术检测到该菌株中含有2,4-二乙酰基藤黄酚(2,4-Diacetyl phloroglucinol,DAPG)的合成相关基因phlD和非核糖体肽合成酶(NRPS)的相关基因nrps1。进一步推断菌株BSR2010的抑制活性可能是由于该菌株能够产生具有拮抗活性的次级代谢产物,为后期代谢产物的分离和鉴定奠定基础。(3)为了提高菌株BSR2010的代谢产物的产量,本研究以菌株的抑菌活性和生物量作为依据,优化菌株BSR2010的培养基组分和发酵条件。结果表明,其发酵产物抑菌活性较高时最佳培养基组分为蔗糖5 g/L、大豆粉10 g/L、NaH2PO410 g/L;最佳发酵条件为接种量:5%,初始pH:6.5,发酵时间:60 h,转速:150 r/min,发酵温度:28℃。本研究为提高菌株BSR2010的代谢产物的积累奠定了基础。(4)为了研究菌株BSR2010代谢产物成分及活性,采用TLC结合显色反应对该菌株可能产生的次级代谢产物类型及最佳萃取剂进行了初步检测。结果表明,该菌株可能产生脂肽类次级代谢产物,并发现次级代谢产物最佳萃取剂为乙酸乙酯。通过制备型HPLC和NMR分离技术对该菌株产生的代谢产物组分进行分离纯化,最终得到4个化合物单体,分别为cyclo(Tyr-Pro)、cyclo(Pro-Phe)、(1H-indol-3-yl)-oxoacetamide、2’,4’,6’-trihydroxyacetophenone。以上4个化合物均是首次从白及内生细菌中分离得到,在医药业中都具有相应的药用价值。本研究结果进一步丰富了白及内生细菌的研究内容,为开发白及内生菌资源和筛选新型抑菌活性化合物奠定了良好的基础。为利用内生菌发酵生产白及活性成分提供了新思路和途径。
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