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由新月弯孢霉(Curvularia lunata)侵染引起的玉米弯孢叶斑病是常见且重要的玉米真菌病害。目前,对于该病原菌的致病机理已有了初步的研究,前期工作已证明MAPK信号传递通路在该病原菌的致病性方面起到重要作用,并且主要通过毒素、黑色素侵染寄主,但关于MAPK信号通路与毒素、黑色素合成途径之间关系缺少深入研究。由于病原真菌毒素、黑色素代谢通路的合成过程中与辅酶类物质(乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A)有密切关系,但在弯孢叶斑病菌中尚不清楚两者在毒素和色素合成及其与MAPK调控的关系。由此本文首先研究玉米弯孢叶斑病菌MAPK通路中与酿酒酵母中参与调控渗透压的Hog1同源的基因Chl1的功能,同时克隆并分析玉米弯孢叶斑病菌中乙酰辅酶A基因ClMfp的功能,在此基础上研究玉米弯孢叶斑病菌中MAPK信号通路基因与毒素、黑色素及两者合成的前体物质--乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A之间可能存在的调控关系。1明确MAPK基因Clh1对病菌致病因子作用的影响通过Blast从玉米弯孢叶斑病菌全基因组序列中获得与酿酒酵母Hog1基因同源性最高的基因序列及其上下游序列,该基因全长2.782kb,cDNA全长1.134kb。为了分析该基因的功能,利用同源重组的方法获得敲除载体,再利用农杆菌介导转化的方法敲除该基因的读码框。与野生型CX-3菌株相比较发现,Clh1敲除突变株在高渗透压环境下,野生型菌株生长速度缓慢,但可继续生长,Clh1敲除突变株完全停止生长;突变株菌丝中甘油含量明显降低,且芽管生长速度减慢;致病性方面,突变株致病性明显降低,且无伤接种致病性要低于有伤接种;纤维素酶的活性和角质酶的活性明显降低。说明Clh1基因参与菌丝渗透压调节,渗透压增加是病菌通过机械压力侵入寄主植物的重要机制之一。2 MAPK信号通路基因可以促进病菌毒素和黑色素的产生,并且抑制寄主植物抗性基因的表达利用荧光定量PCR的方法测定MAPK基因Clk1,Clm1和Clh1对毒素(Clt1,PKS18)、黑色素(Brn1,Scd)及致病相关基因(VelB,eEF3,Sod,Ace1,Hsp104,Tsa1)表达的影响,结果表明MAPK基因(Clk1,Clm1和Clh1)敲除后病菌毒素、黑色素相关基因(Clt1,PKS18,Brn1,Scd)表达明显下降。野生型菌株CX-3侵染玉米叶片过程中,叶片的PR蛋白含量明显升高,而MAPK基因突变株的处理对叶片PR1和PR5表达的刺激作用极明显下降(P<0.01),进一步说明病菌的MAPK基因有利于对寄主防御反应表达。MAPK敲除突变株侵染玉米叶片后,Rp1-dP2的表达量明显提升,说明病菌的三个MAPK基因在侵染过程中可瞬时(接种后48-60h)下调寄主的抗性基因NB-LRR(核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列)的表达,从而提高病菌的侵染能力。高效液相色谱法(HPLC)测定的MAPK基因突变株中毒素(甲基-(5’羟基甲基)呋喃-2-羧酸盐)、黑色素(DHN)的含量均有明显下降。3乙酰辅酶A相关基因ClMfp对病菌产生呋喃毒素和DHN黑色素的影响通过同源重组及农杆菌介导转化的方法,克隆获得全长为3.853kb的ClMfp基因,其中cDNA长1.15kb。ClMfp敲除突变株菌落颜色明显浅于CX-3菌株;该突变株侵染寄主能力明显降低;HPLC测定突变株中毒素(甲基-(5’羟基甲基)呋喃-2-羧酸盐)含量明显降低,且毒素、黑色素及致病相关基因(Clt1,PKS18,Brn1,Scd,VelB,Sod,Ace1,Hsp104,Tsa1)在突变株的表达量明显降低。4辅酶类物质与MAPK基因表达的关联分析研究表明:MAPK敲除突变株中乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的含量明显降低,且MAPK基因在ClMfp突变株中表达量明显降低,同时在MAPK敲除突变株中,乙酰辅酶A基因的表达量也明显降低,并且研究发现,在MAPK敲除突变株孢悬液中分别加入10mM乙酰辅酶A和10mM丙二酰辅酶A后,突变株的致病性增强,并且呋喃毒素含量明显提高。以上研究可以说明MAPK信号系统中的基因对病菌毒素和黑色素的产生和致病力有调控作用,尤其发现MAPK途径影响毒素和色素的前体物质乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的产生,同时两者也可影响MAPK基因的表达。