目的：1.构建谐振型漏声表面波(Leaky surface acoustic wave, LSAW)生物传感器检测技术平台,并建立用于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells, CTCs)检测和蛋白质免疫分析的高灵敏度、高特异性、非标记LSAW生物传感器技术。2.对临床患者标本中泰国伯克霍尔德菌(Burkholderia thailandensis, B. thailandensis)和嗜CO2大肠埃希菌两株罕见的病原菌进行分离和鉴定,并采用全基因组测序分析探讨B. thailandensis的基因组特征。方法：一、LSAW生物传感器的构建及临床应用研究1.以LiTaO3晶体作为压电基底,采用双端对谐振型结构制作LSAW生物传感器,并在此基础上研制2×3型LSAW生物传感器阵列。自行设计LSAW生物传感器信号检测电路,优化传感器信号采集分析软件,并构建谐振型LSAW生物传感器检测技术平台。2.流式细胞技术探讨适配体与MCF-7细胞结合的特异性,采用巯基自组装法将MUC1适配体固定于LSAW生物传感器表面,根据LSAW生物传感器的相位变化,明确巯基自组装法固定适配体的一致性,并确定最佳适配体固定浓度。3.构建用于MCF-7细胞高灵敏、快速检测的非标记适配体型LSAW生物传感器技术,根据LSAW生物传感器相位变化与MCF-7细胞浓度之间的对应关系,探讨适配体型LSAW生物传感器MCF-7细胞检测技术的线性范围、特异性、再生性及稳定性等基本参数。4.采用金黄色葡萄球菌蛋白A (Staphylococcal protein A, SPA)法将环孢霉素A(Cyclosporin A, CsA)单克隆抗体固定于LSAW生物传感器表面,根据LSAW生物传感器的相位变化,探讨SPA法固定单克隆抗体的一致性,并确定最佳抗体固定浓度和最佳反应pH值。5.构建用于CsA检测的高灵敏、非标记LSAW免疫传感器技术,根据LSAW免疫传感器相位变化与CsA浓度之间的对应关系,探讨LSAW免疫传感器CsA检测技术的线性范围、特异性、再生性等基本参数。采用LSAW免疫传感器和均相酶放大免疫分析技术对临床标本中CsA的浓度进行检测,利用Bland-Altman对两种方法检测结果的一致性进行分析,探讨LSAW免疫传感器用于临床标本检测的可行性。二、两株罕见致病菌的鉴定1.分别采用形态学方法、VITEK 2 Compact微生物鉴定/药敏分析系统、API 20NE、16S rRNA基因序列分析对B. thailandensis进行鉴定。2.对致病性B. thailandensis进行全基因组测序分析,明确其基因组特征,并采用比较基因组学方法对致病性B. thailandensis的结构变异、物种进化、特有基因进行分析。3.将嗜CO2大肠埃希菌孵育在普通培养箱和5% CO2培养箱,观察其形态学特征,利用VITEK 2 Compact微生物鉴定/药敏分析系统、API 20E、16S rRNA基因序列分析对嗜CO2大肠埃希菌进行鉴定,并进行抗菌药物敏感性分析。结果：一、LSAW生物传感器的构建及临床应用研究1.双端对谐振型LSAW生物传感器采用Y方向切割36°旋转、X方向传播的LiTaO3晶体作为压电基片,由输入反射栅阵列、输入叉指换能器(Interdigital transducer, IDT)、生物学反应区、输出IDT、输出反射栅阵列五个部分组成。LSAW生物传感器的工作频率为100 MHz,在气相和液相中的相位变化≤±0.1 deg。2.采用相位作为LSAW生物传感器的检测信号,自行设计了传感器的信号检测电路。通过LabVIEW软件开发平台编写了LSAW生物传感器信号采集分析软件BSMS2.0。进一步将LSAW生物传感器、NI-PXI系统、BSMS 2.0软件、计算机、电源等部分有机整合,成功构建了谐振型LSAW生物传感器检测技术平台。3.巯基自组装法固定适配体操作简单且一致性较好,适配体型LSAW生物传感器MCF-7细胞检测技术的最佳适配体固定浓度为2.0μM。4.适配体型LSAW生物传感器MCF-7细胞检测技术的线性范围为1×102 cellsmL-1到1×107 cells mL-1,线性方程为ΔPhase= 0.465 1g C-0.112(C为MCF-7细胞的浓度)。5.适配体型LSAW生物传感器检测Romas细胞和K562细胞的相位变化与检测MCF-7细胞的相位变化存在显著性差异,且适配体型LSAW生物传感器检测Romas细胞和K562细胞的相位变化均在传感器的空白响应范围值内,说明适配体型LSAW生物传感器具有良好的特异性。采用30 mM EDTA作为传感器的再生试剂,适配体型LSAW生物传感器经10次再生后仍保留初始72.7%的相位响应,变异系数为9.79%(<10%)。将适配体型LSAW生物传感器在4℃保存28天,传感器仍保留初始89.51%的相位响应。6.SPA法固定单克隆抗体操作简单且一致性较好,LSAW免疫传感器CsA检测技术的最佳抗体固定浓度为5 mg/L,最佳反应pH值为7.4。7. LSAW免疫传感器CsA检测技术的线性范围为1 ng/mL到1000ng/mL,线性方程为ΔPhase= 0.0039X+0.929 (X为CsA的浓度)。LSAW免疫传感器检测FK506、丙戊酸、地高辛、卡马西平、茶碱的相位变化与检测CsA的相位变化存在显著性差异,且LSAW免疫传感器检测FK506、丙戊酸、地高辛、卡马西平、茶碱的相位变化均在免疫传感器的空白响应范围值内,说明LSAW免疫传感器具有良好的特异性。采用Piranha液(30%H202：浓H2SO4=1：3)作为免疫传感器的再生试剂,LSAW免疫传感器经10次再生后仍保留初始73.53%的相位响应,变异系数为9.33%(<10%)。8.采用Bland-Altman对LSAW免疫传感器和均相酶放大免疫分析技术用于临床标本检测的一致性进行分析,结果表明两种方法的检测结果无显著性差异。二、两株罕见致病菌的鉴定1.采用形态学方法、生化试验、16S rRNA基因序列分析在中国首次对B.thailandensis进行了分离和鉴定。2.首次对致病性B. thailandensis进行了全基因组测序分析,明确了致病性B.thailandensis的基因组特征,并采用生物信息学方法确定了致病性B.thailandensis的遗传变异、特异性毒力因子(VirB/VirD4 type IV secretion system、HSI-I、Mycobactin)、物种进化及特有基因(BPMGL000390、BPMGL000391、BPMGL001875、 BPMGL001949、BPMGL002594)。3.采用形态学方法、生化试验、16S rRNA基因序列分析在中国首次对嗜CO2大肠埃希菌进行了分离和鉴定。结论：1.设计并制作了双端对谐振型LSAW生物传感器及其2×3型阵列。建立了LSAW生物传感器的信号检测电路及信号采集分析系统。在上述研究的基础上,成功构建了谐振型LSAW生物传感器检测技术平台。2.利用适配体识别靶分子的高特异性、高亲和力,结合LSAW生物传感器响应迅速、灵敏度高的特点,成功建立了用于MCF-7细胞高灵敏、快速检测的非标记适配体型LSAW生物传感器技术。适配体型LSAW生物传感器为临床肿瘤转移的早期诊断提供了一种全新的方法,并为肿瘤转移的机制研究奠定了基础。3.将抗原抗体反应的高特异性与LSAW生物传感器的高灵敏度有机结合,成功建立了用于CsA检测的高灵敏、非标记LSAW免疫传感器技术。LSAW免疫传感器为临床药物浓度监测和疾病早期诊断提供了一种全新的免疫分析方法。4.在中国首次对一株临床罕见的B. thailandensis进行了分离和鉴定,并采用全基因组测序分析阐明了致病性B. thailandensis的基因组特征,为全面了解致病性B.thailandensis的毒力、遗传变异、生物学特性奠定了分子基础。5.在中国首次对一株临床罕见的嗜CO2大肠埃希菌进行了分离和鉴定。