论文部分内容阅读
自然界中植物病原细菌、噬菌体和植物共同进化,彼此之间相互依存而又相互牵制。由水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病是水稻最重要的细菌性病害,噬菌体治疗可能作为一种专一且环保的手段用于绿色防控水稻白叶枯病。本研究建立了Xoo的Tn5转座子突变体库,通过筛选抗噬菌体菌株,发现Xoo中感染噬菌体必需的基因,从中再筛选改变水稻致病性的基因,发现Xoo中对噬菌体侵染和植物致病都起作用的基因,探索Xoo中同时在与天敌噬菌体和寄主水稻互作中起作用的基因及其机制。本研究用Tn5转座子突变技术,获得Xoo浙江分离株C2的4524个突变体,通过烈性噬菌体J2侵染C2突变体,筛选到36个对噬菌体侵染产生抗性的突变菌株,再通过反向PCR等分子生物学技术和生物信息学分析,发现Tn5转座子插入19个Xoo中感染噬菌体必需的基因:12个与脂多糖(LPS)合成相关的基因,包括cysB,metB,wxoD,rmlB,rmlA,rfb303,lpxH,编码二磷酸核糖差向异构酶的基因(C268),两个编码糖基转移酶的基因(C2801和C21771)及两个编码假定蛋白基因(C2803和C2820);2个与生物合成相关的基因,包括tagB和编码依赖NAD的脱水酶的基因(C2798),1个与细胞代谢相关的基因etfB,1个编码Tat通路信号蛋白基因,1个编码转座酶的基因,2个编码假定蛋白的基因(C2797和C2802)。将抗噬菌体的Tn5突变株接种到水稻上发现rmlA,rfb303,编码糖基转移酶的基因(C21771),编码含核苷酸二磷酸糖转移酶基序的假定蛋白的基因(C2803)与Xoo的致病力相关。生理生化表型测定发现lpxH在Xoo生长中起作用,cysB,metB,wxoD和rmlB与Xoo运动有关。tagB、编码糖基转移酶的基因(C2801)和两个编码假定蛋白的基因(C2802和C2803)与Xoo的运动和生物膜形成有关。为了验证上述Tn5插入基因是否为Xoo感染噬菌体的必需基因,利用同源重组技术成功构建其中8个基因—cysB,rmlB,rmlA,rfb303,编码糖基转移酶的基因(C21771),编码含核苷酸二磷酸糖转移酶基序的假定蛋白的基因(C2803),tagB,编码Tat通路信号蛋白基因的突变体((35)794、(35)812、(35)813、(35)2234、(35)1771、(35)803、(35)601、(35)3261)和对应的回补体(794-C、812-C、813-C、2234-C、1771-C、803-C、601-C、3261-C)。这8个基因敲除突变体都不能被噬菌体侵染,回补体都恢复了野生型的表型而对噬菌体敏感,从而确证这8个基因是Xoo中感染噬菌体所必需的基因。同时8个基因敲除突变体对水稻的致病性表型与相应的Tn5插入突变体一致,而回补体都恢复了野生型对水稻的致病表型,其中(35)1771、(35)2234、(35)803的致病力降低,表明相应的编码糖基转移酶的基因(C21771)、rfb303和含核苷酸二磷酸糖转移酶基序的假定蛋白(C2803)的基因既是Xoo中感染噬菌体的必需基因,也是Xoo侵染水稻的毒力基因。总之,本研究发现Xoo感染噬菌体必需的基因主要参与LPS合成,决定细菌表面对噬菌体的抗性,部分LPS合成相关基因是Xoo的毒力基因。研究也发现一些新的Xoo感染噬菌体的必需基因,为深入研究Xoo与噬菌体互作及Xoo与噬菌体和水稻共同进化的机制奠定了基础。