【摘 要】
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海洋微生物Streptomycetes sp.Strain W007来源的脂肪酶MAS1是一种具有高效催化性能的高温甘油三酯脂肪酶,其蛋白结构已被解析,为其基于结构信息指导的分子理性改造研究奠定了基础。在脂肪酶的催化过程中,底物结合口袋中的氨基酸残基扮演着重要的角色,会影响酶的性质发生改变。利用蛋白质工程技术从根源上改造酶的催化特性以满足工业需求一直是科学界和工业界关注的热点。本文以脂肪酶MAS1
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海洋微生物Streptomycetes sp.Strain W007来源的脂肪酶MAS1是一种具有高效催化性能的高温甘油三酯脂肪酶,其蛋白结构已被解析,为其基于结构信息指导的分子理性改造研究奠定了基础。在脂肪酶的催化过程中,底物结合口袋中的氨基酸残基扮演着重要的角色,会影响酶的性质发生改变。利用蛋白质工程技术从根源上改造酶的催化特性以满足工业需求一直是科学界和工业界关注的热点。本文以脂肪酶MAS1为研究对象,通过定点突变、大肠杆菌重组表达、蛋白纯化以及酯化反应产物的评估分析,筛选出酯化产物积累偏好性发生改变的突变体,以期为脂肪酶的分子理性改造提供一定借鉴。本论文主要研究内容及结果如下:1.脂肪酶MAS1单点突变的设计及其突变体催化特性研究。利用基因定点突变技术将位于脂肪酶MAS1催化口袋入口的氨基酸T237突变成侧链基团大小不一的氨基酸,获得了T237A、T237E、T237F、T237Q、T237R及T237Y等突变体。在大肠杆菌中重组表达,利用亲和层析技术对目的蛋白进行纯化,同时开展了对突变体酯化反应产物的分析。在反应温度65℃,甘油和油酸摩尔比1:3的条件下反应72 h,发现T237R酯化反应产物中偏甘油酯的含量为43.71%（野生型为36.14%）,其中偏甘油酯/甘油三酯的比例可达到6.32,相比于野生型的1.21,是其5.22倍。2.脂肪酶MAS1双点突变的设计及其突变体催化特性研究。针对位于T237对面的另一个关键位点G40进行突变体的设计,构建了G40D/T237R、G40E/T237R、G40W/T237R、G40R/T237D及G40R/T237E 5个双突变体。通过对突变体催化酯化反应产物的分析,发现在反应温度65℃,甘油和油酸摩尔比1:3的条件下反应72 h,双突变体G40D/T237R酯化反应产物中偏甘油酯的含量为46.4%（野生型为36.14%）,其中偏甘油酯/甘油三酯的比例可达到7.51,相比于野生型的1.21,是其6.21倍。进一步的酶学性质表征发现,双点突变体G40D/T237R在60℃下孵育2 h后,水解酶活力仅残余1.72%,其耐热性较差。3.双点突变体MAS1-G40D/T237R的固定化及其催化应用研究。选择大孔吸附树脂ECR8806并通过物理吸附的方式制备了固定化脂肪酶MAS1-G40D/T237R。通过与游离酶的性质比较,发现固定化后的脂肪酶在60℃下孵育2 h后,水解活力仍残余84.6%,其耐热性显著提高。利用固定化脂肪酶MAS1-G40D/T237R催化酯化反应,在反应温度65℃,甘油和油酸摩尔比1:1,加酶量2%（w/w）的条件下反应24 h,油酸的转化率可达90.29%,偏甘油酯的含量为70.82%。相比于游离酶82.91%的转化率和62.53%的偏甘油酯含量,固定化酶的催化效率要优于游离酶,且固定化脂肪酶MAS1-G40D/T237R在循环使用5次后,仍保持90%的活力。
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