目的:低氧血症是危重新生儿、早产儿最常见的临床表现,缺氧更易导致新生儿体内的细胞代谢和器官功能障碍,甚至威胁生命。氧疗可以提供足够氧浓度以提高氧分压和血液的携氧能力,从而保证组织氧的供给。虽然氧气在临床上是一种最为常见的“药物”之一,但氧疗不当也会引起一系列的问题。早产儿对氧非常的敏感,极易发生氧中毒。氧中毒可直接导致肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞的损伤,使肺泡毛细血管的通透性增高,引发一系列的炎性反应。肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）是一种调节细胞程序性死亡和凋亡的细胞因子,在人的皮肤和肺等多种组织的不同细胞中都有表达。TNF-α可诱导炎症反应,介导多种急慢性的肺疾病,包括高氧诱导的肺损伤。因此,在高氧诱导的肺损伤模型中,TNF-α这一炎症因子最有可能发生相应的变化。TNF-α通过与肿瘤坏死因子受体相互作用发挥其功能,促进肿瘤坏死因子受体相关死亡区域蛋白释放凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase-1,ASK1）结合蛋白与ASK1结合,激活ASK1的活性,进而启动内皮细胞的凋亡过程。有研究表明核因子kappaB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）与TNF-α的合成密切相关,同时我们了解NF-κB是一种氧化应激敏感的核转录因子,包括RelA、RelB、REL、NF-κB1（p50）和NF-κB2（p52）5个家族成员。NF-κB的激活途径主要有两种:经典途径和旁路途径,RelA介导NF-κB经典通路的激活,Rel B介导NF-κB非经典通路的激活。大量的超生理刺激,比如炎症反应等都能够激活NF-κB的两条通路。TNF-α可以促进分泌片（Secretory component,SC）的分泌。有研究表明SC可以对高氧诱导的急性肺损伤有一定的保护作用,并且细胞因子等的上调也对SC的表达产生影响。临床上常用于治疗新生儿的无创给氧方法包括鼻导管吸氧法,面罩吸氧法等,其给氧的常用浓度一般为40%-60%（中等浓度）左右。40%的氧浓度也可以用来提高器官的存活率;世界卫生组织也曾经推荐用40%的氧浓度对一些肺部疾病进行治疗。所以,在我们的研究中,选择40%的氧浓度,目标是比较中浓度的氧（40%O₂）和极度高氧（85%O₂）对肺炎症通路的影响,了解40%O₂对肺部的作用机制,探究中浓度的氧对肺支气管上皮细胞的作用,为临床更为合理的使用氧疗提供理论基础。研究方法:正常人的肺支气管上皮细胞（Normal human tracheobronchial epithelium cells,NHBE cells）培养在含10%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺的DMEM高糖培养基中,放入培养箱中培养（37 oC,5%二氧化碳）,每1到2天更换一次培养基。处理前,将细胞（约1×10⁶/ml）传代,第二天将传代的细胞分别放入含40%（40%氧气和5%二氧化碳）和85%氧气的（85%氧气和5%二氧化碳）三气培养箱中孵育24小时,留在正常培养箱的细胞作为对照组。1、通过细胞增殖（MTT）实验探讨中浓度氧对肺支气管上皮细胞生存能力的影响。2、免疫组织化学技术检测肺支气管上皮细胞RelA、RelB和SC的蛋白表达水平及定位。3、应用蛋白免疫印迹（Western Blot）方法检测肺支气管上皮细胞RelA、RelB、ASK1、TNF-α和SC蛋白的表达水平;4、采用实时定量荧光聚合酶链式反应（Real-time PCR）方法检测肺支气管上皮细胞RelA、RelB、ASK1、TNF-α和SC m RNA的表达水平。所有的实验重复至少6次。实验数据经Prism Graph 6.0软件进行统计分析,结果采用均数±标准差表示。多组间比较采用非配对t检验（unpaired t-test）进行统计,结果以P<0.05有统计学意义。结果:1、中浓度氧对肺支气管上皮细胞有保护作用。MTT实验结果显示40%O₂组（1.2±0.02）与对照组（0.76±0.03）相比,细胞存活率升高（P<0.0001）。85%O₂组（0.48±0.05）与对照组相比,细胞存活率降低（P<0.0001）。中浓度氧对肺支气管上皮细胞有保护作用。2、中浓度氧对肺支气管上皮细胞表达TNF-α的影响。40%O₂组与对照组相比肺支气管上皮细胞TNF-α蛋白含量增加（P<0.0001）,TNF-αmRNA含量上调（P<0.01）;40%O₂组与85%O₂组相比,TNF-α蛋白表达减少（P<0.05）,mRNA含量亦减少（P<0.0001）。3、中浓度氧刺激肺支气管上皮细胞表达ASK1。40%O₂组与对照组相比肺支气管上皮细胞ASK1蛋白含量增加（P<0.01）,ASK1 mRNA含量上调（P<0.0001）;40%O₂组与85%O₂组相比,ASK1蛋白含量降低（P<0.0001）。4、中浓度氧调节了RelA和RelB的表达。4.1免疫组织化学方法对RelA、Rel B的表达进行定位。40%O₂组中RelA和RelB位于细胞核和细胞浆中,与对照组相比细胞核为阳性的细胞明显增多（P<0.0001和P<0.01）,胞浆黄色加深,说明RelA和Rel B被激活。85%O₂组细胞明显胀大,核质分散,形态发生明显改变,从形态学上印证了极度高氧对细胞的损伤。85%O₂组与40%O₂组相比胞浆中的阳性明显增高（P<0.001和P<0.0001）,但RelA和Rel B入核减少。4.2 Western Blot检测细胞中RelA和RelB的蛋白表达。40%O₂组与对照组相比细胞RelA和RelB均升高（P<0.01和P<0.0001）;但与85%O₂组相比细胞RelA蛋白含量降低（P<0.01）,RelB蛋白含量无显著统计学差异。4.3 Real-time PCR检测细胞中RelA、RelB mRNA表达。40%O₂组与对照组相比,RelA mRNA和RelB mRNA含量均上调（P<0.05和P<0.001）。40%O₂组与85%O₂组相比,Rel A m RNA含量下调（P<0.001）。RelB mRNA含量无显著统计学差异。5、中浓度氧影响肺支气管上皮细胞SC的表达。免疫组织化学方法对SC的表达检测显示SC表达在胞浆中,对其光密度分析得出40%O₂组与对照组相比细胞胞浆中的SC未见升高,但85%O₂组不仅明显高于对照组,且与40%O₂组比较SC的表达也明显升高（P<0.0001）。尽管40%O₂组与对照组相比肺支气管上皮细胞SC蛋白含量无显著统计学差异,但SC mRNA含量却明显上调（P<0.0001）;而其与85%O₂组相比,SC蛋白含量减少（P<0.0001）,SC mRNA含量亦减少（P<0.0001）。结论:1.中浓度氧能够促进肺支气管上皮细胞的增殖。2.中浓度氧能够通过促进肺支气管上皮细胞分泌TNF-α,从而激活ASK1和NF-κB通路,并促进肺支气管上皮细胞SC的表达,发挥保护作用。