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胰蛋白酶(EC3.4.21.4)是一种重要的丝氨酸蛋白酶,由胰腺分泌的胰蛋白酶原激活产生,能专一性的水解Arg和Lys羧基端的肽键,能切割自身Arg位点形成自身降解(autolysis)。其中Arg122是人胰蛋白酶-2最重要的自溶位点,封闭该位点可能会改变胰蛋白酶分子的稳定性和催化活性。本论文成功表达了重组人阴离子型胰蛋白酶原(hTg2)及其突变体R122L,分别进行复性、纯化及性质研究。论文同时探讨了三维结构的变化对酶分子性质及催化能力的潜在影响。
采用Plackett-Burman设计正交因子试验优化了hTg2的表达条件,即诱导温度30℃,IPTG浓度0.5mmol/L,Ca离子浓度2.5mmol/L,诱导时间4h。
活性hT2蛋白经过CM-ff阳离子交换层析纯化,研究其性质并分析稳定性。重组hT2发挥活力的最适pH值为7.6,最适温度为60℃:在低温pH3.0～5.0的缓冲液中较为稳定；其活力在pH7.6条件下被典型的金属螯合剂、还原剂、Fe3+及丝氨酸蛋白酶抑制剂所抑制,Ca2+,Cu2+,Mn2+,Zn2+能够维持酶活的相对稳定；而在pH3条件下酶分子局部构象发生变化,从而各种金属离子及金属螯合剂、还原剂(包括EDTA,β-ME,Fe3+等)对酶活的影响都降低到很小的程度。以n-benzoyl-1-arginine ethyl ester(BAEE)作为底物时的米氏常数为0.015mM。
对重组hT2稳定性进行了分析。hT2在20％甘油中以-20℃保存60天,能够保持高于80％的残余酶活；反复冻融8次酶活残余92％；重组hT2酶液通常在低温酸性环境能维持在一个相对稳定的状态,但是pH3条件下酶分子并没有想象中那么稳定,容易发生聚集和沉淀,最为稳定的储存条件是添加10mM CaCl2,pH5缓冲环境。并且在酸性环境中,CaCl2对于重组hT2保护作用也被削弱。推测这些与其在酸性环境中酶蛋白分子构象发生变化,活性中心被掩盖有关,从而提高了自身稳定性。1％甘露醇和1％海藻糖都是重组hT2优良的冻干保护剂,而冻干品最佳储存条件:-20℃密闭保存。
将hTg2的自消化位点Arg122突变为Leu,成功构建了表达载体并表达、纯化mhT2(R122L)。研究突变蛋白的性质,并与野生型进行分析比较。mhT2(R122L)发挥活力的最适pH7～11,最适温度80℃；在低温酸性环境中较为稳定；其活力在pH7.6条件下被典型的金属螯合剂、还原剂、Fe3+及丝氨酸蛋白酶抑制剂所抑制；以n-benzoyl-1-arginine ethyl ester(BAEE)作为底物时的米氏常数为0.010mM。与野生型相比,R122L突变蛋白最适pH范围增大,能够耐受极酸环境,耐热性能也有所提高,与底物BAEE的亲和力增强,同时对于Fe3+、金属离子螯合剂、还原剂以及变性剂等的耐受力也有增强,稳定性大大提高。
基于SWISS-MODEL同源建模,预测该突变蛋白的三维结构,初步探索了mhT2(R122L)的性质变化与其三维结构之间可能存在的关联。发现重组胰蛋白酶Arg122位点突变为Leu后,不仅突变位点处氨基酸侧链的长短和极性发生了改变,位于酶分子活性中心的三个氨基酸(H63,D107,S200)以及底物结合口袋的三个氨基酸(D194,S215,G217)彼此之间分子间距及分子间夹角也都发生了改变,这就有可能导致酶的催化性能和催化效率可能因此而受到影响,最终影响到酶分子的性质和功能。