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研究背景:因肿瘤切除、外伤、正畸、骨发育不良或严重骨折引发的大面积骨缺损需要理想的生物材料来促进骨修复过程。3D生物打印因可通过自动化和高通量的方式精确定位细胞和生物制剂,实现靶器官和组织的精细化及个性化制造,而逐渐被应用到骨组织工程领域。水凝胶是细胞封装系统的金标准材料,但单一光交联水凝胶存在印刷性能差、机械强度不足等缺点,甲基丙烯酰化明胶（Gelatin Methacryloyl,Gel MA）和甲基丙烯酰化透明质酸（Hyaluronic acid Methacryloyl,HAMA）混合的双光交联共聚物可提高支架的强度。为避免过长的光交联时间牺牲封装细胞的活力,可添加多种交联方式或纳米填料以进一步增加支架强度。藻酸盐（Alginate）通过化学交联调控粘度,已成为生物打印中非常有吸引力的水凝胶。氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）易于官能化、提供大的比表面积,与藻酸盐混合亦可提高其机械性能,并具有较高的成骨能力。免疫系统在骨组织再生中起着关键作用,适当的组织愈合需要一系列良好免疫反应级联。为了避免材料植入后过度的急性炎症反应,大部分材料都设计为生物惰性材料,如生物惰性陶瓷,但它没有生物活性,不可避免地会在骨与材料之间形成纤维组织界面,阻碍材料和骨骼的结合。近年来,免疫学与骨组织工程两个领域的交叉融合成为科学界的研究热点,形成了一门新学科——骨免疫学,旨在研究骨组织工程中骨髓中两个系统关键细胞的直接相互作用,通过转录因子、细胞因子及其受体间接连接协调骨修复过程。因此,在3D生物打印骨修复材料的设计中,可以设计出能够调节骨缺损免疫微环境的新一代智能生物活性材料,进一步诱导骨重塑和再生。在细胞选择过程中应考虑免疫调节和骨修复之间的关系。作为免疫的第一道防线,巨噬细胞是炎症的重要调节因子,巨噬细胞的消耗不利于伤口愈合,此外,它还可刺激间充质干细胞成骨分化以增加骨矿化。与细胞系来源的巨噬细胞相比,大鼠骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-derived Macrophages,BMMs）更受青睐,本身也具有一定的成骨能力。为了更好地模拟体内状态,多细胞打印已成为最近的研究趋势,而骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Cells,BMSCs）因其简单的可用性和强大的分化能力而成为另一种选择,除本身具有成骨分化能力,亦拥有促进巨噬细胞M2型极化等免疫调节特性。当同时涉及两种以上细胞类型,若将它们混合在同一通道的生物墨水中进行打印,难以实现各类型细胞的均匀分布,细胞的负载能力也会降低,所以可选用双通道3D生物打印同时引入BMMs和BMSCs两类同物种来源的原代细胞从免疫调节和成骨分化两个角度促进骨修复进程。研究目的:通过引入同物种来源的原代细胞BMMs和BMSCs,将3D生物打印与骨免疫学相互融合,构造3D双通道生物打印支架从早期免疫调节和晚期促成骨两个角度促进骨修复过程。研究方法:1.提取大鼠骨髓来源的BMMs和BMSCs进行细胞培养。通过流式分析对所提取的BMMs进行定性分析。2.通过流变学性能测试确定双通道内生物墨水的可打印性能（封装BMMs第一通道生物墨水:Gel MA+HAMA;封装BMSCs的第二通道生物墨水:Alginate+GO）。通过肉眼,光学显微镜,电镜以及压缩性能测试,观测两通道打印细丝的适配性,筛选合适的生物墨水浓度。3.共聚焦显微镜下通过细胞活死染色进一步筛选第一通道生物墨水中不同浓度的HAMA对BMMs的活性影响,采用细胞活死染色,细胞增殖活性分析对双通道生物打印支架中的BMMs和BMSCs的活性进行分析。4.评价BMMs和BMSCs的相互串扰。通过聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）和免疫荧光分析评价BMSCs对BMMs的炎症因子表达以及M1和M2极化的影响;通过PCR和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）生成分析,茜素红分析评价BMMs对BMSCs的成骨分化的影响。5.建立大鼠颅骨缺损模型,将3D双通道打印支架分为0组,BMMs组,BMSCs组,BMMs+BMSCs组,分别植入骨缺损,1周内通过苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,H＆E）染色,马松（Masson）染色,免疫组化分析颅骨缺损微环境的血管生成,成骨趋势,炎症因子表达以及巨噬细胞的极化情况;4周,8周后通过Micro-CT,H＆E染色,Masson染色,免疫组化分析评价骨修复效果。研究结果:1.通过流式细胞术定性分析表示成功提取了大鼠BMMs。2.封装BMMs第一通道生物墨水（Gel MA+HAMA）和封装BMSCs的第二通道生物墨水（Alginate+GO）均具有良好的剪切性能,温度敏感性和可打印性能;当第一通道选用8%Gel MA+1%HAMA,第二通道选用3%Alginate+0.5mg/ml GO作为生物墨水时,支架显示良好的机械性能,不易塌陷和变形。3.8%Gel MA+1%HAMA封装的BMMs的细胞活性最良好;当双通道打印支架中同时引入BMMs和BMSCs时,显示两类细胞的生长活性和增殖活性均良好。4.BMMs和BMSCs的串扰分析显示BMSCs可促进BMMs的M2型极化,抑制促炎因子表达,促进抗炎因子表达;BMMs可促进BMSCs的成骨基因表达以及成骨分化,钙盐沉积。5.双通道生物打印支架植入大鼠颅骨缺损后,封装了双细胞组（BMMs+BMSCs组）较单细胞组（BMMs组,BMSCs组）以及无细胞组（0组）均在早期骨缺损微环境中更有效地进行了免疫调节,促进巨噬细胞M2极化,晚期促进新骨生成也具有更良好的效果。结论:我们选用具有良好流变学性能和生物相容性的双通道混合生物墨水(第一通道生物墨水:8%Gel MA+1%HAMA;第二通道生物墨水:3%Alginate+0.5mg/ml GO,打印出具有良好结构和机械性能的3D打印支架,创新性地引入大鼠BMMs和BMSCs分别作为第一通道和第二通道所封装的细胞,从而促进大鼠颅骨缺损早期微环境巨噬细胞的M2极化,促进血管生成并诱导晚期骨形成。这可能为3D生物打印领域的骨免疫修复提供新的思路和方法。