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牛结核病是由牛分枝杆菌所引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病,人可因感染牛分枝杆菌而发生结核,因此牛结核病不仅关系到畜牧业的持续发展,而且直接影响人类的健康。国际上普遍采取“检疫-扑杀”的措施控制该病的传播。尽管有关牛结核检测方法有多种,但快速、灵敏、特异的方法在我国还没有建立,因此本研究通过研制的抗牛γ-干扰素单克隆抗体建立了牛IFN-γ竞争抑制ELISA方法和胶体金免疫层析检测牛结核IFN-γ方法。初步临床应用显示ELISA方法对临床奶牛样本IFN-γ的检测结果与结核菌素皮肤试验(Tuberculin Skin Test,TST)结果符合率为83.4%；胶体金免疫层析检测结果与TST结果符合率为78.6%,胶体金免疫层析检测结果与进口试剂盒结果的符合率为85.7%,进口试剂盒检测结果与TST检测结果符合率为78.6%。此结果为进一步研究开发特异性和敏感性更高的牛IFN-γ的检测方法奠定了基础,为我国牛结核病的防控提供了一种比较简便的检测手段。1.抗BoIFN-γ特异性单克隆抗体的研制及鉴定利用大肠杆菌表达融合蛋白GST-BoIFN-γ的细菌裂解上清作为抗原免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞与SP2／0细胞进行融合,以表达GST-BoIFN-γ的大肠杆菌超声波裂解物和表达GST的大肠杆菌超声波裂解物分别作为包被抗原,通过间接ELISA方法平行筛选获得了3株抗BoIFN-γ的单克隆抗体,分别命名为BoIFN-γ-5G7、BoIFN-γ-6G7和BoIFN-γ-6D11。Western-blot试验证实,本研究所获得的单克隆抗体均能与表达GST-BoIFN-γ融合蛋白的重组菌反应,识别分子量为42kD特异性蛋白质条带,与表达GST的非重组菌不反应；间接免疫荧光试验(IFA)结果证实,单抗能特异性识别Sf9细胞表达的重组BoIFN-γ,在荧光倒置显微镜下可见亮绿色荧光。捕获ELISA方法进行亚类鉴定结果表明,单抗6G7和5G7为IgG2a亚类,单抗6D11为IgM亚类。5G7单抗腹水的效价可以达到1：409600,细胞上清效价可达到1：20000,6G7单抗腹水和细胞上清的效价分别为1：204800和1：4000,6D11单抗腹水和细胞上清的效价分别为1：12800和1：2560。中和试验结果表明,单抗6G7对大肠杆菌表达的rBoIFN-γ和杆状病毒真核表达系统表达的rBoIFN-γ具有一定的中和作用。本研究所获得的三株单抗为建立检测BoIFN-γ的方法提供了条件。2.竞争抑制ELISA检测BoIFN-γ方法的建立及初步应用用GST琼脂糖凝胶FF柱纯化大肠杆菌表达的重组GST-BoIFN-γ,按不同浓度梯度包被ELISA酶标板,筛选最佳抗原包被浓度；用Hi-Trip Protein G柱纯化单克隆抗体BoIFN-γ-6G7,测定最小饱和抗体量；然后将待检样品与定量的单克隆抗体BoIFN-γ-6G7作用后加入到包被抗原的ELISA酶标板上,37℃湿盒进行竞争反应,再与1：10000稀释的HRP标记兔抗鼠酶标抗体作用并以底物显色,建立了一种有效检测奶牛天然IFN-γ竞争抑制ELISA方法。用建立的该方法检测北京临床样品23份和江苏某奶牛场样品30份,结果表明,北京样品全部为阳性,与进口试剂盒检测结果完全一致。江苏某奶牛场30份样品中有8份阳性,3份可疑,其余为阴性,检测结果与结核菌素皮内试验符合率为83.4%。3.胶体金免疫层析检测BoIFN-γ方法的建立及初步应用以柠檬酸三钠法制备直径为30nm左右的胶体金溶液,调节pH值至8.3；以3.3μg/ml的单抗BoIFN-γ-6G7标记胶体金,用10%BSA和10%PEG-20000稳定胶体金溶液；离心后用PB稀释液稀释金标复合物,喷玻璃纤维素膜；NC膜上分别以0.6μl/cm和0.8μl/cm的量喷C、T线,组装试纸条。用试纸条对江苏某奶牛场14份血样进行检测,结果7份阳性,3份可疑,4份阴性,与结核菌素皮肤试验(TST)符合率为78.6%,试纸条检测结果与进口试剂盒检测结果符合率达85.7%,进口试剂盒与TST检测结果符合率为78.6%。综上结果表明,本研究建立的竞争抑制ELISA和胶体金免疫层析法检测牛IFN-γ进行结核的检疫具有快速、灵敏、特异性好的特点,适于基础兽医工作人员牛结核的检验检疫,为我国牛结核病的防控提供了一种比较简便的检测方法。