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光作为一种重要的环境因素,对植物的发育和生长至关重要。土壤中萌发的幼苗,从萌发后的黑暗生长到破土而出、见到阳光,会经历暗形态建成到光形态建成的发育转变。在拟南芥中,光敏感色素互作因子PIFs是光形态建成的关键抑制因子,在黑暗下会大量积累并促进植物的暗形态建成。植物光受体感受到光后,能迅速引发PIFs的磷酸化修饰,进而引发PIF的降解并启动植物的光形态建成。光诱导PIFs的磷酸化修饰对其随后的降解必不可少,一直是光生物学领域的研究热点。迄今为止,虽然负责PIF磷酸化修饰的激酶已被大量报道,但介导PIF去磷酸化修饰的蛋白磷酸酶还知之甚少。在本论文中,我们发现丝/苏氨酸蛋白磷酸酶PP6能介导PIFs去磷酸化修饰,并在黑暗下抑制了植物的光形态建成。
FyPP1和FyPP3是PP6磷酸酶的两个催化亚基,它们的无义突变体幼苗fypp1fypp3(f1 f3)在黑暗中呈现出光形态建成的表型:较短的下胚轴、张开的子叶、消失的顶端弯钩,类似于黑暗下生长的pifq突变体(pif1 pif3 pif 4 pif5)幼苗。我们发现,FyPP1和FyPP3主要在黑暗和光下生长的幼苗的子叶和下胚轴中表达。遗传分析显示pifqf1f3六突突变体的下胚轴长度与亲本pifq和f1f3类似,显著短于Col;说明PP6和PIFs协同抑制了植物在黑暗下的光形态建成。另外,f1f3和pifqf1f3突变体在持续红光下也有较短的下胚轴,说明PP6和PIFs在持续红光下也协同促进了下胚轴的延伸。突变体表型观察结果表明PP6是拟南芥光形态建成负调控因子。
在黑暗生长的f1f3幼苗中,我们检测到PIF3和PIF4蛋白被磷酸化修饰引起的缓慢迁移的条带。通过进一步的生化实验验证,PP6能与PIF蛋白相互作用,并直接调控了PIF3和PIF4蛋白的去磷酸化修饰。通过比较黑暗生长的f1f3和pifq幼苗的转录组数据,我们证实了PP6介导了大量的PIFs调控基因的表达。其中,鉴定到了266个受PP6调控的PIF4靶标基因,它们主要富集在光响应和促进生长等生物途径。PP6介导的磷酸化修饰,抑制了PIF3和PIF4对下游靶标基因HFR1、IAA19的激活,但并不影响PIF对下游靶基因启动子区域的结合能力。这些遗传、分子和生化的数据证实了,PP6通过介导PIF蛋白的去磷酸化修饰,正调控了PIF蛋白的转录活性,进而抑制了植物在黑暗下的光形态建成。
在去黄化过程中,红光能诱导PIF蛋白的迅速降解,PP6能减缓PIF4的降解速率,但并不影响PIF3的降解。另外,PP6通过上调PIF4的mRNA和蛋白水平,促进PIF4蛋白在持续白光下的积累。在f1f3突变体中超表达PIF4蛋白,也能显著恢复f1f3在持续红光下的短下胚轴表型。遗传和生化实验证实,PP6通过抑制PIF4在去黄化过程和持续白光下的降解,进而微调植物的下胚轴在光下的延伸。
总之,本研究通过遗传、分子、生化等诸多试验手段,揭示了新型磷酸酶PP6通过正调控PIF蛋白转录活性和/或蛋白稳定,及抑制拟南芥光形态建成的功能和分子机理,进而完善了植物光形态建成的分子调控网络。
FyPP1和FyPP3是PP6磷酸酶的两个催化亚基,它们的无义突变体幼苗fypp1fypp3(f1 f3)在黑暗中呈现出光形态建成的表型:较短的下胚轴、张开的子叶、消失的顶端弯钩,类似于黑暗下生长的pifq突变体(pif1 pif3 pif 4 pif5)幼苗。我们发现,FyPP1和FyPP3主要在黑暗和光下生长的幼苗的子叶和下胚轴中表达。遗传分析显示pifqf1f3六突突变体的下胚轴长度与亲本pifq和f1f3类似,显著短于Col;说明PP6和PIFs协同抑制了植物在黑暗下的光形态建成。另外,f1f3和pifqf1f3突变体在持续红光下也有较短的下胚轴,说明PP6和PIFs在持续红光下也协同促进了下胚轴的延伸。突变体表型观察结果表明PP6是拟南芥光形态建成负调控因子。
在黑暗生长的f1f3幼苗中,我们检测到PIF3和PIF4蛋白被磷酸化修饰引起的缓慢迁移的条带。通过进一步的生化实验验证,PP6能与PIF蛋白相互作用,并直接调控了PIF3和PIF4蛋白的去磷酸化修饰。通过比较黑暗生长的f1f3和pifq幼苗的转录组数据,我们证实了PP6介导了大量的PIFs调控基因的表达。其中,鉴定到了266个受PP6调控的PIF4靶标基因,它们主要富集在光响应和促进生长等生物途径。PP6介导的磷酸化修饰,抑制了PIF3和PIF4对下游靶标基因HFR1、IAA19的激活,但并不影响PIF对下游靶基因启动子区域的结合能力。这些遗传、分子和生化的数据证实了,PP6通过介导PIF蛋白的去磷酸化修饰,正调控了PIF蛋白的转录活性,进而抑制了植物在黑暗下的光形态建成。
在去黄化过程中,红光能诱导PIF蛋白的迅速降解,PP6能减缓PIF4的降解速率,但并不影响PIF3的降解。另外,PP6通过上调PIF4的mRNA和蛋白水平,促进PIF4蛋白在持续白光下的积累。在f1f3突变体中超表达PIF4蛋白,也能显著恢复f1f3在持续红光下的短下胚轴表型。遗传和生化实验证实,PP6通过抑制PIF4在去黄化过程和持续白光下的降解,进而微调植物的下胚轴在光下的延伸。
总之,本研究通过遗传、分子、生化等诸多试验手段,揭示了新型磷酸酶PP6通过正调控PIF蛋白转录活性和/或蛋白稳定,及抑制拟南芥光形态建成的功能和分子机理,进而完善了植物光形态建成的分子调控网络。