论文部分内容阅读
背景多药耐药是影响胃癌化疗疗效的主要因素之一,临床应用的多药耐药逆转剂效果并不理想,青蒿琥酯(artesunate,Art)为中药青蒿的主要成分,研究证明可诱导凋亡抑制人胃腺癌细胞MKN45和SGC7901的生长,还可逆转肺癌A549细胞和耐阿霉素T淋巴细胞的多药耐药,但是尚未查到Art对胃癌耐药细胞的耐药逆转报道。阿霉素属于一线抗癌蒽环类抗生素,课题组用逆转录病毒载体导入mdr1cDNA于SGC7901细胞构建了胃癌耐药细胞SGC7901/mdr1。目的以胃癌细胞SGC7901为对照,观察Art对耐药细胞SGC7901/mdrl的阿霉素耐药性的变化；探讨其逆转过程中有无细胞凋亡与Bcl-2表达的改变。方法1.细胞培养：将SGC7901和SGC7901/mdr1细胞接种于含10%胎牛血清的1640培养基中,置于37℃、5%CO2、95%湿度条件下的孵箱中培养。2.MTT法：将不同细胞分组并加入不同药物,每组3个复孔,用MTT法求肿瘤细胞抑制率,计算半数和20%抑制浓度(IC50和IC20),将培养的SGC7901和SGC7901/mdr1细胞加入不同浓度的Art,确定Art逆转SGC7901/mdr1细胞阿霉素耐药性的浓度；加入不同终浓度的阿霉素并不断调整最大和最小终浓度,直至对SGC7901/mdr1和SGC7901细胞的抑制范围均涵盖50%的抑制率,确定涵盖阿霉素抑制SGC7901/mdr1和SGC7901细胞50%终浓度；确定好的不同浓度阿霉素,SGC7901细胞设为亲本对照组,SGC7901/mdr1细胞设为Art阴性对照组,SGC7901/mdr1细胞再加入确定的Art耐药逆转的浓度设为实验组,判断Art对耐药细胞SGC7901/mdr1的耐药逆转效果。3.Art对耐药细胞SGC7901/mdrl凋亡、Caspase-3及Bcl-2蛋白影响的检测：将培养的细胞分为4组,加入IC20浓度的Art和阿霉素设为实验组,分别加入同浓度的Art或阿霉素分别设为Art对照组和阿霉素对照组,只加入IC20浓度,空白对照组不加药物。药物作用48小时后,AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色,荧光显微镜观察细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞的凋亡率；提取细胞总蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,用辣根过氧化物酶标记的二抗发光显影法,以1：2000的β-actin抗体为内参,用1：1000的Caspase-3多克隆抗体检测Caspase-3的表达及其活性,用1：500的Bcl-2单克隆抗体检测Bcl-2蛋白表达。4.统计学处理：应用SPSS19.0软件进行统计学处理,计量数据用均数±标准差(x±s)表示,比较采用方差分析,方差不齐时进行变量转换；计数资料计算阳性率,比较用x2检验；检验水准α=0.05。结果1.Art对SGC7901/mdrl细胞的耐药逆转作用：Art作用48h后,对SGC7901/mdrl和SGC7901细胞的IC20差异无统计学意义(P>0.05),对SGC7901/mdrl细胞的耐药逆转浓度为二者IC20平均值即110.0μg/ml。作为对SGC7901/mdrl细胞。涵盖阿霉素抑制SGC7901/mdrl和SGC7901细胞50%的终浓度是3.125、6.250、12.500,25.000、50.000(μg/ml)。阿霉素对实验组细胞的IC50低于Art阴性对照组的(P<0.05),和亲本对照组比较无明显差异(P>0.05)；Art对耐药细胞SGC7901/mdrl的耐药逆转倍数约是2.31倍,相对逆转率约为83%。2.Art对耐药细胞SGC7901/mdrl的凋亡：在荧光显微镜下,实验组凋亡细胞数量较多,Art对照组、阿霉素对照组和空白对照组的凋亡细胞数量很少。流式细胞术结果的统计学分析显示,实验组的细胞凋亡率高于Art对照组、阿霉素对照组和空白对照组(P<0.05),Art对照组、阿霉素对照组和空白对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。3.Art对耐药细胞SGC7901/mdrl的Caspase-3蛋白的影响：Western Blot检测的半定量统计学分析显示：Caspase-3蛋白的表达在实验组高于Art对照组和空白对照组(P<0.05),接近阿霉素对照组(P>0.05)；活化片段(17KD)在实验组高于其他组(P<0.05)。4.Art对耐药细胞SGC7901/mdrl的Bcl-2蛋白表达的影响：Western Blot检测的半定量统计学分析显示：实验组Bcl-2蛋白表达明显弱于其他3组(P<0.05),Art对照组、阿霉素对照组和空白对照组的Bcl-2蛋白表达差异不明显(P>0.05)。结论Art可以逆转耐药细胞SGC7901/mdrl对阿霉素的耐药性,其逆转机制与减弱Bcl-2的表达使细胞凋亡增多有关。