研究背景:银屑病（Psoriasis）是一种常见的慢性炎症性疾病,其病因和发病机制尚不清楚。银屑病皮损的主要病理学变化是角化不全、角化过度、炎症细胞浸润以及血管异常增生。国内外对银屑病发病机制的研究很多,且多着重于表皮角质形成细胞异常或者是免疫系统紊乱引起发病方面的研究。大多数研究显示免疫紊乱与其发病密切相关。过去的研究基本上集中于银屑病患者体内的Th1/Th2的失衡。近年来发现一种新型的不同于Th1和Th2细胞的Th17细胞,越来越被重视,可能在银屑病的发病机制中更为重要。银屑病的发病机制复杂,多种炎症细胞、细胞因子及生长因子等参与发病[1]。事实上,维持机体正常功能的基本生物学机制之一是细胞间信息的传递,而这种信号传递的异常导致多种异常增殖性疾病（如肿瘤）的发生[2]。由此,从信号转导着手研究银屑病发病机制,可能会找到银屑病发病的关键机制,并有助于指导治疗。研究表明[3-6]STAT3的异常活化可以促进细胞分化增殖、抑制细胞凋亡,最终导致细胞增殖异常和（或）恶性转化,从而导致多种疾病的发生。而活化的STAT3可直接作用于VEGF的启动子调节表达。更值得关注的是STAT3-VEGF信号通路激活频率高,与肿瘤细胞的异常增殖和转移密切相关。因此,阻断STAT3的激活,下调VEGF的表达,有望成为控制肿瘤发展的靶向治疗手段。因此,STAT3和VEGF在角质形成细胞异常增殖的银屑病患者中是否存在高表达,并协同导致银屑病发病值得深入研究。目前研究发现,银屑病患者STAT3蛋白高表达于皮损表皮中下层细胞的胞浆及胞核中,其表达水平在血液中也显著升高,并与病情的严重程度呈正相关[7,8]。提示STAT3在银屑病发病中起重要作用。VEGF是血管发生的最重要的有效介质。银屑病患者皮损和血清中VEGF表达水平也较正常人增加。此外,银屑病真皮血管异常增生及通透性增加,驱使银屑病皮损水肿及大量炎症细胞侵润,加剧银屑病的发展。提示银屑病的反复发作可能与皮损内真皮乳头的微血管内皮细胞的过度表达有关。尽管多数研究证实了STAT3和VEGF在银屑病发病中的重要作用,然而银屑病发病机制复杂,影响因素纵多,需要进一步深入研究。前面我们提到,Th17在银屑病发病中的作用已成为国内外研究的热点,并且不断证实Th17细胞在银屑病发病中越来越重要,为深入研究银屑病的发病机制及治疗提供了新的思路。综上所述,STAT3、VEGF和Th17共同参与银屑病的发生。由此,我们推测Th17细胞内可能存在一条信号通路,某些刺激因子激活这条通路,引起其发生改变（如增殖、功能异常等）,最终导致银屑病的发病。Th17细胞在发育和功能发挥上不同于Th1、Th2细胞,其高表达IL-17、IL-21、IL-22,同时也产生IL-6和TNF-α等[9]。Th17细胞的生长发育需要IL-6和TGF-β的初始激活及IL-23的维持,受STAT3转录因子的调控。有研究表明[10],STAT3和VEGF都参与了 Th17细胞的分化过程,对Th17细胞的发育起重要的作用,同时影响其效应因子功能的发挥。因此,有必要深入研究在银屑病患者中STAT3和VEGF是否与Th17细胞有关及STAT3-VEGF通路是否为Th17增殖、发挥功能的途径。为了解决上述问题,我们拟从银屑病患者外周血中分选出Th17细胞进行体外培养。利用RNA干扰技术,设计针对STAT3的特异性siRNA,运用Liprofectamine2000转染试剂将其转导至Th17细胞中,沉默STAT3基因。然后,采用荧光定量PCR和Western-blot检测沉默后STAT3、VEGF基因及蛋白表达情况,并筛选最佳沉默序列,以期进一步探讨银屑病的发病机制。他克莫司是一种大环内酯类免疫调节剂,特异性地抑制T细胞,广泛运用于器官移植中。近年来,他克莫司外用治疗银屑病,显示出良好的效果,且副作用少,可长期维持使用。但是,他克莫司的具体作用机制仍不清楚。有实验证明他克莫司可抑制Th17细胞的增殖及分化,减少IL-17 mRNA的表达。且低浓度的他克莫司即可阻断原始T细胞向Th1、Th2和Th17亚群分化,抑制IFN-γ,IL-4及IL-17等的生成。还有研究发现他克莫司可抑制STAT3的磷酸化,降低VEGF的表达。由此,我们推测他克莫司可能通过STAT3-VEGF通路作用于Th17细胞,抑制Th17细胞的分化及效应因子的分泌,进而起到治疗银屑病的作用。我们以前研究也表明,他克莫司培养组的Th17细胞相关因子IL-22、IL-23的表达水平明显下降,并在他克莫司浓度为50ng/ml组表达量最低;同时,STAT3与VEGF的mRNA表达量也处于最低水平。基于这些研究结果,我们运用上述最佳的STAT3沉默序列,继续转染Th17细胞,沉默STAT3基因,并加以50ng/ml他克莫司培养24小时后检测STAT3、VEGF基因及蛋白表达情况。进一步探讨他克莫司治疗银屑病是否通过影响Th17中的STAT3-VEGF通路发挥作用。为阐明他克莫司的作用位点提供实验依据,并为针对银屑病细胞信号转导途径中相关的、潜在的药物作用靶点提供理论依据。目的:通过RNA干扰技术沉默银屑病患者Th17的STAT3基因,检测STAT3、VEGF基因及蛋白表达情况,并比较筛选最佳的沉默序列。运用上述最佳沉默序列继续沉默Th17,并加以50ng/ml他克莫司培养24小时后,检测STAT3、VEGF基因及蛋白表达情况。方法:1、抽取一例银屑病患者外周血20ml,采用流式细胞术筛选Th17细胞并进行体外培养。2、siRNA-STAT3的构建和转染:①从基因数据库（如www.ncbi.nlm.nih.gov）搜索人的STAT3mRNA全基因序列,利用BLAST软件进行同源性分析。②将对比好的STAT3mRNA全基因序列作为模版,根据siRNA的设计原则,设计三对siRNA。③按照设计的序列,合成siRNA-STAT3-001、siRNA-STAT3-002、siRNA-STAT3-003,同时设立对照组（广州伯信生物科技有限公司提供服务）。④采用Lipo2000转染试剂将制备好的上述siRNA转导至Th17细胞中。3、沉默效果检测:采用荧光定量PCR和Western-blot检测RNAi沉默后STAT3、VEGF基因及蛋白表达情况,并比较筛选最佳沉默序列。4、药物干预:运用上述筛选的最佳siRNA沉默Th17细胞,结合50ng/ml他克莫司处理24h后,运用荧光定量PCR和Western-blot检测STAT3、VEGF基因及蛋白变化情况。结果:1、基因沉默STAT3后,STAT3、VEGF的mRNA和蛋白的表达水平都下降,且发现siRNA-STAT3-003序列沉默的效果最好。2、他克莫司处理组和Si-STAT3-003组的STAT3、VEGF的mRNA及蛋白表达水平均有所下降,而他克莫司结合siRNA-STAT3-003沉默处理组STAT3、VEGF的mRNA及蛋白水平下降较前两组明显。结论:1、RNAi沉默STAT3后,STAT3的mRNA和蛋白表达下调,并且下游VEGF的表达水平也下调,进一步证实了 STAT3-siRNA在基因和蛋白水平对靶基因VEGF的表达的抑制。说明STAT3-VEGF信号通路的激活可能通过影响Th17的增殖、功能亢进等导致发病。由此推测,STAT3-VEGF通路是银屑病发病的一个潜在关键点,通过沉默STAT3,下调VEGF的表达,可成为靶向治疗银屑病的一种新方法。2、他克莫司处理组和Si-STAT3-003组的STAT3、VEGF的mRNA及蛋白水平都下降,相差不明显,说明他克莫司可能通过抑制STAT3-VEGF通路的激活发挥治疗作用。而他克莫司结合siRNA-STAT3-003沉默处理组的STAT3、VEGF的表达较前两组下降明显,说明他克莫司可能还通过别的途径抑制STAT3和VEGF的表达,提示STAT3-VEGF信号通路受到多种因素的调控,尚需进一步研究。本实验有助于深入了解Th17在银屑病发病中的作用以及他克莫司对其相关信号通路的影响,进一步为今后研究、开发针对银屑病炎症中的细胞信号转导途径中相关的、潜在的药物作用靶点的抗银屑病药物在临床应用提供理论依据。值得关注的是本次实验制备的Lipo2000-Si-STAT3-003转染Th1 7细胞,可使STAT3、VEGF mRNA和蛋白的表达水平明显下调,有望成为靶向治疗银屑病的一个重要生物制剂。