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生殖健康是健康的基石,维护与促进生殖健康是人类社会进步与发展的支柱、动力和保证。然而许多生殖系统相关疾病可以影响人类的生殖健康。例如,隐睾是小儿泌尿外科常见的影响生殖健康的疾病之一,研究表明即使对隐睾患儿进行了早期的药物或者手术干预,成年后其仍可能发生不育,不育的发生机制仍待研究。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESC)和具有ESC特性的诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells,i PSC)具有自我更新和多向分化的潜能,已经成为研究疾病发生和发展的有力工具。体外诱导人ESC/i PSC向生殖细胞分化,可以模拟人类胚胎发育过程中生殖细胞的发育过程,对于研究各种男性生殖系统相关疾病的发生机制、药物毒理学及再生医学等具有重大意义。目前小鼠ESC/i PSC向生殖细胞分化的诱导体系已经较为成熟,诱导得到的单倍体精子,注射到可受精母鼠的卵细胞内,可以培育出具有生殖能力的健康后代。然而,人ESC/i PSC向生殖细胞诱导分化的研究进展则相对比较缓慢,诱导得到的多是较为早期的生殖细胞,分化较为后期的生殖细胞仍未得到。此外,各个研究组所报道的诱导效率和可重复性都比较低。因此,探索一套适用于人的i PSC向生殖细胞分化的诱导方案十分必要。根据生殖细胞在体内的发育规律,本研究第一部分制定了一套由盐酸强力霉素(Doxycycline,Dox)诱导骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP4)过表达联合双氢睾酮(Dihydrotestosterone,DHT)、维甲酸(Retinoic acid,RA)组成的三步法诱导分化方案,诱导正常人体细胞来源的i PSC向男性生殖细胞分化。通过形态学观察、荧光定量PCR、免疫荧光染色、人工计数等方法,探索该三步法诱导方案诱导人i PSC向男性生殖细胞分化的潜能。形态学变化表明:随着诱导因子的逐步加入,完整的i PSC克隆开始出现分化,至21天诱导结束,分化的细胞呈小圆型,大小均一;荧光定量PCR及免疫荧光染色结果显示:在诱导过程中,生殖细胞早期和中期阶段特异性标志物表达明显增加,至21天诱导结束,检测到了减数分裂及精子细胞特异性标志物SYCP3、TEKT1和ACROSIN的表达;人工计数结果显示:第二阶段诱导结束,生殖细胞特异性标志物VASA的表达阳性率约为53.52±3.94%,第三阶段诱导结束,减数分裂及精子细胞特异性标志物SYCP3和ACROSIN的表达阳性率分别为34.46±2.86%,14.85±1.29%。综上,由Dox诱导BMP4过表达联合DHT、RA组成的三步法诱导分化方案,可以有效的诱导人i PSC向生殖细胞方向分化,诱导至最后阶段,可以获得一定量的精子细胞。在本研究第二部分中,我们以分化至不同阶段的生殖细胞为体外研究模型,从生殖细胞发育学的角度,探讨环境类雌激素己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)对不同发育阶段生殖细胞的影响。研究结果表明:高浓度的DES对生殖细胞的增殖活力有明显的抑制作用,导致生殖细胞死亡数量增加;DES可以通过影响生殖细胞早期和晚期阶段基因的表达,从而导致生殖细胞的发育成熟障碍。第一部分:诱导多能干细胞向生殖细胞分化的初步研究【目的】构建具有人类遗传学背景的体内外生殖细胞研究模型,对于了解生殖细胞的体内发育过程、研究男性生殖系统疾病的发生及发展等具有重要意义。本研究制定了一套由Dox诱导BMP4过表达联合DHT、RA组成的三步法诱导分化方案,探索该方案诱导人i PSC向男性生殖细胞分化的潜能。【方法】首先通过慢病毒转染,构建由Dox调控的Tet-On诱导BMP4过表达系统。然后诱导分三个阶段进行:(1)第一阶段,Dox持续诱导7天;(2)第二阶段,DHT持续诱导7天;(3)第三阶段,RA持续诱导7天。在诱导各阶段,通过形态学观察、荧光定量PCR、免疫荧光染色、人工计数等方法,评估该三步法诱导方案对于促进人i PSC向男性生殖细胞分化的潜能。【结果】(1)形态学变化表明:Dox加入7天后,克隆已完全失去边界,分化的细胞呈圆型或小梭型;DHT诱导7天,分化的细胞呈圆形或小梭型,有较多细胞团出现;至21天诱导结束,分化的细胞呈小圆型,并且在整个分化过程中,细胞整体分化状态较为均一、同步。(2)荧光定量PCR及免疫荧光染色结果表明:Dox诱导7天,多能性基因OCT4、NANOG的表达明显下调(P<0.05),原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGC)阶段特异性基因PRDM1、STELLA表达明显升高;DHT诱导7天,OCT4、NANOG的表达持续下调,PRDM1、STELLA的表达持续增加,生殖细胞中期阶段标志物DAZL、VASA表达明显增加(P<0.05),此外,减数分裂及精子细胞特异性标志物SYCP3、TEKT1和ACROSIN开始微量表达;RA诱导7天,DAZL、VASA的表达开始下降,SYCP3、TEKT1和ACROSIN的表达显著增加(P<0.05)。(3)人工计数结果表明:第二阶段诱导结束,VASA的表达阳性率约为53.52±3.94%,第三阶段诱导结束,SYCP3和ACROSIN的表达阳性率约为34.46±2.86%,14.85±1.29%。【结论】由Dox诱导BMP4过表达联合DHT、RA组成的三步法诱导方案,可以有效的促进人i PSC向生殖细胞方向分化;通过该诱导方案,诱导至最后阶段可以获得一定量的精子细胞。第二部分:乙烯雌酚的生殖毒性检测【目的】以人i PSC体外向男性生殖细胞的发育模型为基础,研究DES对不同发育阶段生殖细胞的影响。【方法】将处于早期(诱导至第7天)、中期(诱导至第14天)及晚期(诱导至21天)阶段的生殖细胞分别培养于空白对照组(完全培养基)、溶剂对照组(0.1%DMSO)和DES浓度分别为0.1、1、10、50μg/ml的培养基中24h。光镜下观察DES处理前后细胞的形态学变化;CCK-8细胞增殖与凋亡法检测DES处理后细胞增殖活力的变化;荧光定量PCR检测DES处理后各阶段生殖细胞特异性基因PRDM1、SYCP3、TEKT1、ACROSIN的表达变化。【结果】(1)50μg/ml的DES可以显著抑制不同发育阶段生殖细胞的增殖活力,引起生殖细胞死亡数量增加,0.1、1、10μg/ml的DES对于各阶段生殖细胞的增殖活力没有明显影响。(2)与正常对照组相比,溶剂对照组各阶段细胞的基因表达均没有明显变化;0.1、1、10、50μg/ml的DES处理后,PRDM1、SYCP3、TEKT1、ACROSIN的表达均呈下降趋势,与正常对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),而VASA的表达变化与正常对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。【结论】高浓度的DES可以显著抑制不同发育阶段生殖细胞的增殖活力,引起死亡细胞数量增加;DES可以影响早期和晚期阶段生殖细胞特异性基因的表达,从而导致生殖细胞的发育成熟障碍。