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丝裂原活化蛋白激酶信号通路(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)是不同的分裂、增生、凋亡信号转导通路的汇集点，该信号通路也存在于造血系统肿瘤、上皮发生肿瘤的发生发展中。在哺乳动物细胞中研究较多的主要有ERK、JNK、p38三条信号通路。一般认为，JNK和p38通路与凋亡发生、炎症反应等有关，而ERK信号通路主要调节细胞的增殖、分化，并抑制凋亡的发生。针对MAPK信号通路的小分子抑制剂的发现使人们有可能利用已发现的细胞分子生物学的理论和机制指导开发新的治疗方法。越来越多的临床前研究证实MEK抑制剂能增强传统化疗药物的疗效。近十多年来的研究显示，三氧化二砷(arsenictrioxide，As2O3)对新确诊的和复发的急性早幼粒白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)病人有显著的疗效。最近，大量的体内和体外实验证明，As2O3对部分实体瘤也有显著的疗效。As2O3的作用机制复杂，在白血病细胞中主要通过作用于PML-RARα和PML蛋白而诱导分化和凋亡。最近的研究显示，As2O3还可能作用于广泛的细胞信号通路而诱导肿瘤细胞凋亡。但是，As2O3诱导实体瘤细胞凋亡的机制还不完全清楚。As2O3可以激活MAPK信号通路，并且由于特定细胞的组织起源和特异性不同而有所差异。我们的预试验结果也显示As2O3诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡过程中ERK1/2的活性明显升高，并呈剂量效应关系。As2O3对多数实体瘤的显著凋亡诱导效应的浓度一般在2μM以上，远远高于对APL细胞的凋亡诱导浓度(0.5μM)。因此探讨MEK抑制剂与As2O3联合运用以降低As2O3的使用浓度，从而达到增强疗效和降低毒性的研究具有重要的意义。另外，JNK和p38通路在As2O3诱导实体瘤细胞凋亡中的作用也有待阐明。
JWA基因(AF070523.1)是周建伟等1998年发现并克隆的受维甲酸诱导的新基因。通过对其结构分析发现，JWA基因cDNA包含2088个核苷酸，编码188个氨基酸，其启动子序列中含有多种反应元件，如TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13acetate)反应元件(TRE)、hemin反应元件(HRE)、热休克反应元件(hRE)、应激反应元件(SRE)和ATRA反应元件(ARE)半位点等。在JWA编码蛋白中有两个含丝氨酸残基的PKC(proteinkinaseC)磷酸化位点(SDR-SLR)。课题组前期的研究证实，JWA不仅广泛地参与调节多种分化和/或凋亡诱导剂(如TPA，ATRA，4HPR和As2O3)涉及的信号通路，而且活跃地参与细胞对应激刺激(如氧化应激和热应激)的应答。但是JWA参与调节细胞分化/凋亡作用中的具体机制尚不明确。作为不同的分裂、增生、凋亡信号转导通路的汇集点的MAPK信号通路与JWA是否存在交互作用，它们在信号通路中的上下游关系如何?活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)与细胞凋亡密切相关，化学诱导剂(如As2O3)是否通过H2O2调节JWA?TPA作为PKC激动剂是否通过磷酸化JWA蛋白的PKC位点而诱导细胞分化?这些都是本课题关心的问题。因此，本课题准备一方面对MAPK信号通路(ERK、JNK、p38)在As2O3诱导实体瘤细胞凋亡中的机制作初步探讨，为MEK抑制剂和As2O3联合运用提高As2O3对实体瘤的疗效提供理论和实验依据；另一方面对JWA参与调控细胞分化、凋亡的机制作进一步研究，为阐明JWA的结构、功能及其相互关系提供实验依据。
本课题选择两种实体瘤细胞株MCF-7和HeLa，利用As2O3作为凋亡诱导剂，研究MAPK信号通路(ERK、p38和JNK)在As2O3诱导的细胞凋亡中的作用；着重探讨了MEK抑制剂对As2O3诱导凋亡的增强作用及其机制；利用构建的JWA低表达MCF-7和HeLa细胞，研究JWA对As2O3诱导的细胞生长抑制、细胞凋亡和DNA损伤等的影响；初步探讨了JWA和ROS、MAPK信号通路的关系；利用PCR引入突变法构建JWA编码蛋白中两个PKC磷酸化位点(SDR-SLR)突变的载体，初步研究TPA诱导MCF-7细胞分化中JWA的作用机制。结果表明：
1.MAPK信号通路对As2O3诱导MCF-7和HeLa细胞凋亡有重要调节作用
在人乳腺癌MCF-7细胞中，As2O3能诱导细胞生长抑制(MTT分析结果)，并呈剂量-效应和时间-效应关系。As2O3作用24，48和96h的半数抑制浓度(IC50)分别为8.6，3.3和1.86μM。Hoechst33258染色后荧光显微镜观察以及AnnexinV-PI双染后流式细胞仪检测证实As2O3能诱导细胞凋亡。As2O3能激活MCF-7细胞中MEK/ERK信号通路，而该通路的激活可能削弱As2O3的作用效果。因此我们进一步研究As2O3和MEK抑制剂联合作用是否能增强MCF-7细胞的生长抑制和凋亡。MEK抑制剂U0126(10μM)或者PD98059(20μM)与As2O3(2，5μM)联合作用后显著增强MCF-7细胞的生长抑制作用(MTT法和3H掺入法)。进一步的研究结果显示，U0126或者PD98059与As2O3联合作用能显著增强MCF-7细胞的凋亡(Hoechst33258染色，荧光显微镜观察，和AnnexinV/PI染色，流式细胞仪检测)。另外，As2O3也能剂量依赖地激活p38，但是不激活JNK。p38抑制剂处理不能抑制诱导的细胞凋亡，但MEK抑制剂能增强As2O3诱导的MCF-7细胞凋亡。
在人宫颈癌HeLa细胞中，As2O3能剂量依赖地诱导HeLa细胞凋亡(Hoechst33258染色)。以1、2、5μMAs2O3处理HeLa细胞24h，其凋亡率分别为5﹪、16.7﹪、27.5﹪。As2O3能剂量依赖地激活(磷酸化)ERK、p38、JNK(Westernblot检测)。同时也能检测到Bad的磷酸化。已知，Bad作为Bcl-2家族中促凋亡成员之一，能将与Bcl-2或Bcl-xL结合的Bax替换出来，促进凋亡的发生。Bad在Ser112的磷酸化可抑制Bad与Bcl-2和Bcl-xL的结合。MEK抑制剂PD98059(20μM)处理后，能显著增强As2O3所诱导的细胞凋亡，同时As2O3所致的ERK磷酸化和Bad磷酸化被抑制。JNK抑制剂SP600125(10μM)处理后，则显著抑制As2O3所诱导的细胞凋亡。p38抑制剂对As2O3所诱导的细胞凋亡无显著影响。实验结果提示，ERK信号通路在As2O3诱导的HeLa细胞凋亡中起负调控作用，MEK抑制剂和As2O3联合作用能增强HeLa细胞凋亡，Bad去磷酸化可能是MEK抑制剂的作用机制；JNK在As2O3诱导的HeLa细胞凋亡中起正调控作用。JNK激活状态在两种实体瘤细胞MCF-7和HeLa中的不一致性，可能是由于细胞类型的不同所致。
2.JWA在As2O3诱导的细胞生长抑制、DNA损伤和细胞凋亡中的作用
As2O3处理MCF-7和HeLa细胞后，Westernblot检测JWA蛋白表达水平呈剂量依赖性升高。利用构建的JWA基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-asJWA，经脂质体转染MCF-7和HeLa细胞，G418筛选获得JWA低表达的稳定细胞株asJWA-MCF-7和asJWA-HeLa，同时以pEGFP-C1转染并筛选获得表达空载体的稳定细胞株C1-MCF-7和C1-HeLa。As2O3(2，5，10μM)处理C1-MCF-7和asJWA-MCF-7细胞，分别以MTT法、彗星试验、Hoechst染色(和/或流式细胞仪)检测细胞的生长抑制、DNA损伤和细胞凋亡。结果发现，As2O3能剂量依赖地诱导C1-MCF-7细胞的生长抑制、DNA损伤和细胞凋亡，而对asJWA-MCF-7细胞，As2O3诱导的生长抑制、DNA损伤和细胞凋亡作用减弱。As2O3(1，2，5μM)处理C1-HeLa和asJWA-HeLa细胞时，出现相似的情况，即与C1-HeLa相比，As2O3诱导asJWA-HeLa细胞生长抑制、DNA损伤和细胞凋亡作用减弱。这些结果说明JWA在As2O3诱导的细胞生长抑制、DNA损伤和细胞凋亡中起正调控的作用，提示JWA可能发挥类似抑癌基因的作用。
3.JWA和ROS、MAPK信号通路的关系及其在As2O3诱导的细胞凋亡中的作用
为观察JWA和ROS的关系，我们利用DCFH-DA染色方法，在荧光显微镜下检测到As2O3诱导HeLa细胞凋亡过程中ROS显著增加，Westernblot检测到JWA表达水平升高；进一步，使用过氧化氢酶(catalase)可以抑制As2O3诱导的ROS的产生，说明这种ROS是以过氧化氢的形式存在。ROS被过氧化氢酶抑制后，JWA表达水平也受到抑制，同时细胞凋亡率显著下降。这些结果提示：ROS在As2O3诱导细胞凋亡中发挥作用；ROS是JWA的上游调控因子，ROS/JWA可能是As2O3诱导细胞凋亡的机制之一。
4.JWA编码区PKC磷酸化位点突变对TPA诱导MCF-7细胞分化的影响
基于课题组以前的研究，我们推测TPA作为PKC激动剂可能通过作用于JWA编码区中两个PKC磷酸化位点而发挥作用。