【摘 要】
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研究背景糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy,DR）最初被认为是一种微血管疾病,但是越来越多的研究发现在视网膜微血管病变之前,视网膜神经细胞即出现了变性改变。在神经变性的过程中,小胶质细胞发挥了重要作用。已有研究表明,在一些视网膜退行性疾病中,小胶质细胞在特定环境下被激活、迁移以及极化状态改变会降低光感受器细胞的活性甚至焦亡。本课题组前期在糖尿病动物模型中亦发现小胶质细胞发生
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研究背景糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy,DR）最初被认为是一种微血管疾病,但是越来越多的研究发现在视网膜微血管病变之前,视网膜神经细胞即出现了变性改变。在神经变性的过程中,小胶质细胞发挥了重要作用。已有研究表明,在一些视网膜退行性疾病中,小胶质细胞在特定环境下被激活、迁移以及极化状态改变会降低光感受器细胞的活性甚至焦亡。本课题组前期在糖尿病动物模型中亦发现小胶质细胞发生了上述变化,但其在不同糖浓度下的被极化状态及不同极化状态下对光感受器细胞的影响尚缺乏研究。二甲双胍是一种广泛用于治疗2型糖尿病的双胍类降糖药物,除了有降低血糖的作用外,对全身许多系统均有保护神经细胞及抗炎作用。最近的一项研究发现二甲双胍显著减少了视网膜变性小鼠的光感受器细胞焦亡,同时也显著抑制了视网膜外核层小胶质细胞的激活,在脑缺血小鼠模型中发现,二甲双胍通过诱导小胶质细胞向M2型极化促进了新生脑血管的形成。我们猜测,二甲双胍在DR中可能会通过影响小胶质细胞的活性和极化状态从而影响光感受器细胞。研究目的1.探索不同葡萄糖浓度下小胶质细胞（BV2细胞）的活化和极化状态。2.探讨高糖环境下二甲双胍对小胶质细胞极化状态和光感受器细胞（661W细胞）活性的影响。研究方法1.免疫荧光检测小胶质细胞活化标记物CD1 1b的表达,确定促进BV2细胞活化的最佳葡萄糖浓度。2.将BV2细胞分为对照组、高糖组（75mmol/L糖浓度）和二甲双胍+高糖组（2mmol/L的二甲双胍在75mmol/L糖浓度下干预BV2细胞）;Western blot检测各组BV2细胞M1型标记物iNOS、CD86与M2型标记物Arg-1、CD206的蛋白表达水平;ELISA检测炎症因子IL-6、TNF-α、IL-4的表达。3.将各组BV2细胞与661W细胞共培养24 h;MTT法测661W细胞增殖率,Tunel法和流式细胞术测661W细胞的焦亡率。研究结果1.细胞形态观察及免疫荧光结果显示75mmol/L糖浓度可以最大程度激活BV2细胞。2.Western blot检测结果示:与对照组比较,高糖组BV2细胞中M1型标记物iNOS、CD86的蛋白水平增高,M2型标记物Arg-1、CD206的蛋白水平降低,差异均具有统计学意义（t=16.783、-11.605、4.325、4.649,P<0.05）;与高糖组比较,二甲双胍+高糖组与BV2细胞M1、M2型标记物蛋白表达则呈相反趋势（t=7.231、5.560、-8.035、-8.824;P<0.01）。ELISA 检测结果示:与对照组比较,高糖组BV2细胞分泌促炎因子IL-6、TNF-α含量增多,抗炎因子IL-4含量减少,差异均具有统计学意义（t=-64.312、-127.147、71.547;P<0.001）;与高糖组比较,二甲双胍+高糖组则呈相反趋势（t=44.426、83.232、-143.115;P<0.001）。3.BV2细胞与661W细胞共培养24h,MTT检测结果显示:高糖组与对照组相比,661W细胞活性降低;二甲双胍+高糖组与高糖组相比,细胞活性升高（t=7.456、-3.076;P<0.05）。Tunel法及流式细胞术检测结果显示:与对照组相比,高糖组661W细胞焦亡个数增多,焦亡率上升（t=-22.248、-22.628;P<0.001）;与高糖组相比,二甲双胍+高糖组661W细胞焦亡个数减少,焦亡率下降（t=11.767、6.906;P<0.01）。研究结论在高糖环境下,小胶质细胞向M1型极化,介导炎症反应,加重光感受器细胞焦亡;二甲双胍可调控小胶质细胞向M2型极化,降低炎症因子的表达,从而减轻光感受器细胞的焦亡。为DR的临床治疗提供了新的方向和思路,并为二甲双胍在视网膜疾病中的应用确定了新的可能性。
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