替加环素是首个用于临床抗感染的甘酰胺四环素药物,其抗菌谱广,对多重耐药细菌中也表现出较好的体内外抗菌活性,因而被认为是治疗耐药菌感染的最后一道防线。近年来,抗生素的大量及不合适使用导致耐药病原菌急剧增加,严重影响了公共卫生安全。tet（X）基因编码的灭活酶是首个可以直接灭活替加环素的新型耐药基因,它最初于20世纪80年代在专性厌氧菌脆弱拟杆菌的R质粒上发现。tet（X）基因的变体tet（X4）于2019年被我国科学家发现,该耐药基因位于可转移质粒上,且介导了替加环素的高水平耐药。已有研究表明,细菌在获得耐药性的同时,也将获得其带来的适应性代价,这是影响耐药细菌流行进化的关键因素。然而,目前关于耐药基因tet（X4）的表达是否对宿主菌造成适应性代价、是否存在低适应性代价的组合以及宿主菌调控的分子机制尚不清楚。因此,本研究中将系统探究tet（X4）介导的高水平替加环素耐药性的适应性代价,并解析背后的适应性代价调节机制,为替加环素耐药菌的防控提供科学依据。首先测定了 tet（X4）表达对不同宿主菌产生的适应性代价。将构建的重组质粒pBAD-HisA-tet（X4）利用电转化方法分别导入到大肠杆菌TOP10、肠炎沙门氏菌ATCC13076和肺炎克雷伯菌ATCC700603中,并测定tet（X4）的表达对宿主菌的适应性代价,包括生长曲线、竞争实验和毒力评价。结果发现tet（X4）的表达对大肠杆菌TOP10产生的适应性代价最小,于是选择大肠杆菌TOP10作为后续研究的宿主菌。接着通过将不同类型的质粒导入TOP10,筛选出最低适应性代价的质粒。转入5种tet（X4）阳性单拷贝质粒后发现,IncFⅡ型质粒pC41产生的适应性代价最小。大蜡螟幼虫模型结果表明TOP10/pC41表现了和TOP10相当的致病力,而其他组合的致病力显著降低。以上结果表明大肠杆菌TOP10和pC41的组合表现出最低的适应性代价。为了评价该菌株质粒组合的稳定性和潜在危害,分别用含抗生素和不含抗生素的培养基对TOP10/pC41进行传代进化,评价传代过程中细菌的耐药性、接合转移能力、生物膜形成和毒力的变化。结果表明,TOP10/pC41在无抗和有抗传代进化后,pC41质粒均能在宿主菌中稳定存在,且适应性代价基本保持不变,甚至在含抗传代后适应性略有升高。值得注意的是,TOP10/pC41传代后对替加环素的MIC值升高,接合转移频率升高,细菌的生物被膜形成能力增强,并且毒力逐渐增强。通过对传代前后的tet（X4）和pC41质粒进行基因组测序,并未发现非同义突变位点,暗示适应性相关表型的变化可能归功于相关基因表达的变化。以上体外实验证实TOP10/pC41具有高度稳定的相对适应性,但在体内的适应性代价还需进一步研究。为了验证TOP10/pC41在体内感染中是否具有极佳的适应性,本研究构建了小鼠肠道菌群清除模型,以排除肠道菌群的干扰,并进一步测定了TOP10/pC41的体内接合能力和竞争适应性。结果表明,TOP10/pC41在小鼠肠道中的接合转移能力与体外接合频率一致,体内竞争能力同样与体外相当,没有表现出适应性代价。体内定植实验表明TOP10/pC41具有很强的致病性和定植能力,对于体内复杂环境依然保持了很高的接合频率和竞争能力。此外,我们也发现抗HIV药物叠氮胸苷在体内外实验中均能显著降低TOP10/pC41的接合转移和竞争能力,为阻断tet（X4）阳性质粒的传播扩散提供了新思路。以上结果表明了大肠杆菌和IncFII型质粒pC41具有成为流行菌株的潜力,然而其分子机制还有待进一步研究。为了找到pC41中对适应性代价调控相关的基因,我们筛选到了同是IncFII型质粒的pC59质粒,并测定了其相对适应性,生物被膜形成能力和致病性。结果发现,pC59质粒表现出了与pC41截然相反的适应性代价趋势。pC59导入后给宿主菌TOP10带来很强的适应性代价,同时TOP10/p59的生物被膜形成能力与毒力都显著低于TOP10/pC41。利用Nanopore对两个质粒进行三代测序并比对,发现pC41比pC59多了约3.5 kb的核酸序列,命名为3K。此外,3K的核酸序列中包含了一段假定蛋白序列（atlR）。利用CRISPR-Cas9技术分别构建3K和atlR基因的敲除菌株,并利用质粒回补的方法将3K和atlR进行回补。结果表明,敲除3K或atlR后,pC41的适应性代价显著升高,基本与pC59相当。而质粒回补后发现pC41的适应性代价显著下降,回到了敲除前的水平。以上结果表明,IncFII型质粒pC41中的3K和atlR基因直接参与了适应性代价的调节。耐药基因表达水平的变化与宿主菌的适应性代价直接相关,因此我们猜测3K和atlR基因可能调控了 tet（X4）基因的表达水平。基于此,我们测定了 TOP10/pC41、TOP10/pC41Δ3K和TOP10/pC41ΔatlR的tet（X4）基因表达水平。结果发现,TOP10/pC41Δ3K 和 TOP10/pC41ΔatlR的tet（X4）表达比 TOP10/pC41 要高约 4 倍,表明TOP10/pC41Δ3K和TOP10/pC41ΔatlR的适应性代价升高可能归因于tet（X4）表达量的升高。考虑到tet（X4）基因表达与质粒拷贝数密切相关,因此我们测定了 TOP10/pC41以及TOP10/pC41Δ3K和TOP10/pC41ΔatlR的质粒拷贝数的变化。结果发现,3K和atlR基因敲除后质粒的拷贝数显著升高,而回补两个基因均显著降低了质粒拷贝数,表明tet（X4）基因表达量的升高可能是因为质粒拷贝数的增加。接着利用lacZ作为报告基因测定了 IncFⅡ质粒复制基因repA的表达量变化,结果发现3K和atlR基因回补后的repA的表达量出现下降。此外,通过点突变实验发现+260、+261、+262和+263四个位点的突变会破坏DNA结合位点,几乎消除了 3K和atlR对repA表达的抑制作用,表明这四个位点可能是调节子AtlR与RepA的mRNA的结合位点。这些结果表明,3K和atlR基因通过抑制了 IncFⅡ质粒pC41的复制,降低了耐药基因tet（X4）的表达,最终调控了宿主菌的适应性代价。综上,本研究系统探究了耐药基因tet（X4）介导的高水平替加环素耐药性对宿主菌的适应性代价及其调控机制。研究发现TOP10/pC41的组合在体内外具有最低的适应性代价,且传代进化可进一步增强其耐药和毒力水平。机制研究表明,质粒上的一个全新的调节子AtlR可以通过抑制质粒的拷贝数来降低耐药基因的表达,以提高菌株的适应性。以上发现为后续防控tet（X4）基因的流行传播以及开发新型细菌耐药性防控策略奠定了科学基础。