巨噬细胞是一种重要的免疫细胞,它在杀灭病原体,递呈抗原和调节免疫应答的过程中发挥着重要作用。迄今为止,关于鸡巨噬细胞的体外分离培养鲜有报道。本次研究使用细胞系L929和HD-11细胞系的细胞上清液刺激骨髓来源和外周血来源的巨噬细胞,首先通过多组交叉实验,以前体细胞的浓度、刺激因子的终浓度、以及培养的时间作为变量,优化筛选出最优的巨噬细胞体外培养的条件。在最优条件下培养巨噬细胞,待其到达最优培养天数后,通过核染实验以及小鼠红细胞(mRC)吞噬实验观察它们的形态学特征和吞噬功能,通过普通PCR检测了表面标志CD11b的特异性基因,并将所得序列进行比对。最后,将活化的巨噬细胞分别与LPS和小鼠的红细胞继续培养,使用荧光定量PCR的方法检测特征性细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、iNOS、TGF-β、TNF-α)基因的转录水平以及免疫分子(MHCI-α、MHCII-β、Ii)基因的转录水平。结果显示巨噬细胞的最优培养条件为:前体细胞的初始浓度为6×105个/mL、刺激因子HD-11-CM和L929-CM的终浓度为30%,以及巨噬细胞的最优培养天数为5~8天。在最优条件下得到的活化的巨噬细胞呈现出梭形、细胞核增大、具有吞噬功能的特征。此外,这些细胞高水平转录特征性基因cd11b。结果显示,与对照组相比,在受到两种不同的刺激剂刺激而产生极化的巨噬细胞的Mhc和Ii基因的转录量显著降低(P<0.01)。在LPS的的刺激下体外培养所得的四组细胞均向M1方向进行极化,表现为巨噬细胞转录M1特征细胞因子IL-12、IL-6、IL-2和iNOS的水平升高显著(P<0.01),TNF-ɑ升高(P<0.01),但IL-1β表达量下降(P<0.05);同时M2型特征细胞因子IL-10转录水平显著下降(P<0.01),而TGF-β转录水平明显升高(P<0.01)。小鼠红细胞刺激极化的成熟骨髓源巨噬细胞转录M1型特征性细胞因子IL-12显著升高(P<0.01),IL-6、IL-2的升高(P<0.05),而IL-1β、iNOS、TNF-α转录水平则显著下降(P<0.01),M2型特征性细胞因子L-10和TGF-β转录水平也显著下降(P<0.01)。这些结果不仅提供了鸡巨噬细胞体外培养的生物学特征,而且表明了刺激剂影响巨噬细胞体外极化的作用。综上所述,本次研究建立了血液源和鸡骨髓源巨噬细胞体外分离培养极化的方法。通过在形态学、功能学以及分子水平的检测证明培养所得的四种细胞(L929-CM刺激的骨髓源巨噬细胞、L929-CM刺激的血液源巨噬细胞、均为功能性巨噬细胞、HD-11-CM刺激的骨髓源巨噬细胞、HD-11-CM刺激的血液源巨噬细胞)为巨噬细胞。分别使用LPS和mRC成功诱导成熟的巨噬细胞发生极化后,通过相对荧光定量PCR的方法检测结果显示极化后的巨噬细胞MhcI-α、MhcII-β和Ii基因的转录水平都显著下调,LPS诱导的巨噬细胞的和mRC诱导的巨噬细胞在M1/M2特征性细胞因子的转录水平上存在差异。