论文部分内容阅读
目的:运用中医证素辨证分析手段,分析高血压前期患者的证候及证素,并归纳其常见证型,依据高血压前期证型主要为脾虚痰湿证采用电针结合中药灸贴观察其延缓高血压前期大鼠心肌纤维化的作用,以Sirt1/TLR4/NF-κB信号通路为切入点,以此尝试阐释电针结合中药灸贴对高血压前期大鼠的作用机制,以丰富“从脾论治”高血压前期的科学内涵。材料与方法:1临床研究:本研究运用回顾性调查研究的手段,采用提取病例病案信息结合问卷调查的形式,设计建立高血压前期患者中医证素特征信息采集表,探讨高血压前期患者的中医证候分布情况,依据纳入排除及剔除标准对明确诊断为高血压前期的患者通过收集其一般资料,证候表现及舌脉等四诊信息,运用SPSS19.0建立数据库,采用频数分析归纳总结四诊信息,并用因子分析提取主要病位、病性证素,结合中医基础理论手段整合病位、病性证素,总结高血压前期主要证型及分布规律,进一步深入探讨高血压前期主要病因病机及治则治法。2实验研究:采用随机数字表法将7周龄盐敏感大鼠32只分成4组,每组8只,即模型组、针刺组、中药穴位贴敷组(简称贴敷组)、针刺+中药穴位贴敷组(简称针刺+贴敷组)。7周龄盐抵抗大鼠8只为空白组。各组大鼠于动物实验中心适应性喂养1周。用8%高盐饲料喂养并监测鼠尾动脉压,当血压达到130~139mm Hg和(或)85~89mm Hg时即为高血压前期造模成功。空白组及模型组大鼠每日固定器捆绑20 min,针刺组每日固定器捆绑大鼠,针灸针刺入双侧“足三里”及“曲池”穴,针柄分别接电针仪,强度以大鼠肢体局部微微颤动为度(1-2 m A),选用疏密波,频率4/20 Hz,各波形分别持续10/15s,每日治疗20 min,“足三里”位于大鼠膝关节后外侧,腓骨小头下约5mm,直刺7mm;“曲池”穴位于桡骨近端的关节外侧前方的凹陷中,直刺4mm。贴敷组每日将中药颗粒研磨成粉末后与姜汁混合成糊状,制作成直径为2 mm大小的中药丸固定于大鼠的双侧“脾俞”穴进行贴敷,再将穴位贴贴敷在中药丸上,非药物部分以棉垫隔离皮肤,最后用胶布缠绕鼠身每日固定灸贴6小时后去除,“脾俞”穴定位:第12胸椎下两旁肋间。针刺+贴敷组每日固定器捆绑大鼠,电针大鼠双侧“足三里”、“曲池”穴,电针方法同针刺组,电针后将含药穴位贴贴敷于大鼠双侧“脾俞”穴,方法同贴敷组。以上干预措施均每日一次,6天为一疗程,共治疗4疗程。干预结束后,将全部大鼠禁食不禁水24 h,测量各组大鼠体重,按照0.6ml/100g将10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠;麻醉成功后将大鼠仰卧位固定于操作台上,胸部皮肤备皮,以0.5%碘伏对胸部皮肤消毒处理,剪开胸骨暴露心脏,取部分心脏放于干净的器皿中,生理盐水冲洗干净,并修剪心脏周围的结缔组织,用中性蛋白酶及胶原酶消化心脏组织制备成单细胞悬液并用相应荧光抗体标记对应抗原,其余心脏置于冰上剪除多余组织,生理盐水冲洗干净后部分4%多聚甲醛固定,室温避光保存备用,部分-80℃冰箱保存备用。采用智能无创血压计测量大鼠鼠尾动脉收缩压,超声心动图评价左心室质量指数及左心室射血分数,HE染色观察心脏组织病理改变,masson染色半定量分析心脏组织胶原纤维容积分数,流式细胞术检测心脏组织中巨噬细胞百分比,ELISA法测定心脏组织IL-6、IL-1β、TNF-α含量,RT-PCR法检测心脏组织Sirt1、TLR4、My D88、TRAF6、IKKβ、NF-κBm RNA表达,Wes一体机检测心脏组织Sirt1、TLR4、My D88、TRAF6、IKKβ、NF-κB蛋白表达,免疫组化法检测心脏组织Sirt1、TLR4、p-NF-κB蛋白阳性表达密度。实验数据采用SPSS19.0进行统计学处理,评估数据资料是否为正态分布,并将正态分布数据进行方差齐性检验。计量资料以(?)±s表示,组间比较采用单因素方差分析,若数据不符合正态分布则采用非参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1高血压前期中医证素研究1.1一般情况:151例高血压前期患者中,以男性多见,68人,占45.03%,各年龄段高血压前期患者分布不同,但以45-59岁年龄段最多见,共86例,占56.95%。吸烟、饮酒及嗜食高盐饮食患者以45-59岁年龄段分布最多,分别为31例,占52.54%,43例,占64.18%,14例,占51.85%,1.2四诊信息分布特点:按频数统计,高血压前期症状以目眩(64.24%)、头痛(54.97%)、口苦(54.03%)、头晕(49.01%)、懒言(44.37%)、舌淡胖(43.05%)、乏力(41.06%)最常见。1.3证素分布特点:高血压前期病位证素为脾、肝、肾,病性证素为痰湿、气虚、热、阴虚。其中脾为最常见的病位证素,92例,占45.32%,痰湿为最常见的病性证素,92例,占32.97%。1.4证候分布特点:高血压前期证候分为四类,脾虚痰湿,肝火亢盛,阴虚阳亢,气阴亏虚,其中脾虚痰湿证型所占比例最高,为92例,占36.08%。2电针结合中药灸贴延缓高血压前期大鼠心肌纤维化作用研究2.1电针结合中药灸贴对高血压前期大鼠血压作用研究干预4个疗程后针刺组、贴敷组、针刺+贴敷组鼠尾动脉收缩压水平均低于模型组,针刺+贴敷组血压下降较其余两组明显(P<0.05)。2.2电针结合中药灸贴对高血压前期大鼠心肌纤维化作用通过心脏超声发现,针刺组、贴敷组、针刺+贴敷组比模型组左心室质量指数下降,(P<0.05)。HE染色显示针刺组、贴敷组、针刺+贴敷组心肌细胞排列较模型组整齐,心肌间质内炎症细胞浸润较少,针刺+贴敷组更明显。masson染色表明针刺组、贴敷组、针刺+贴敷组心肌胶原纤维生成较模型组减少,针刺+贴敷组更明显(P<0.05)。免疫组化显示针刺组、贴敷组、针刺+贴敷组α-SMA阳性表达密度低于模型组,且针刺+贴敷组明显(P<0.05)。3基于Sirt1/TLR4/NF-κB信号通路探讨电针结合中药灸贴延缓高血压前期大鼠心肌纤维化作用机制研究3.1流式细胞术检测大鼠心肌组织巨噬细胞比例与空白组比较,模型组心肌组织中巨噬细胞百分比明显上升(P<0.05),与模型组比较,针刺组,贴敷组,针刺+贴敷组心肌组织中巨噬细胞百分比下降(P<0.05),针刺+贴敷组下降更显著(P<0.05)。3.2ELISA法检测大鼠心肌组织IL-6、IL-1β、TNF-α含量与空白组比较,模型组大鼠心肌组织IL-6、IL-1β、TNF-α含量上升(P<0.05),与模型组比较,针刺组,针刺+贴敷组大鼠心肌组织IL-6、IL-1β、TNF-α含量下降,贴敷组IL-1β含量下降(P<0.05),针刺+贴敷组下降更显著(P<0.05)。3.3 RT-PCR法检测大鼠心肌组织Sirt1、TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB、IKKβm RNA表达水平模型组TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB、IKKβm RNA表达水平与空白组相比上调,Sirt1m RNA表达水平与空白组相比下降(P<0.05),与模型组相比,针刺组、贴敷组、针刺+贴敷组TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB、IKKβm RNA表达水平均下降,Sirt1m RNA表达水平升高(P<0.05),其中针刺+贴敷组m RNA表达水平改变较针刺组及贴敷组显著(P<0.05)。3.4 Wes一体机检测大鼠心肌组织Sirt1、TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB、IKKβ蛋白表达水平与空白组比较,模型组TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB、IKKβ蛋白表达增高,Sirt1蛋白表达降低(P<0.05),与模型组相比,针刺组、贴敷组、针刺+贴敷组TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB、IKKβ蛋白表达均有所下降,Sirt1蛋白表达升高(P<0.05),针刺+贴敷组蛋白表达改变较针刺组及贴敷组显著(P<0.05)。3.5免疫组化法检测大鼠心肌组织Sirt1、TLR4、p-NF-κB蛋白表达阳性密度与空白组比较,模型组TLR4、p-NF-κB蛋白表达阳性密度增高,Sirt1蛋白表达阳性密度降低(P<0.05),与模型组相比,针刺组、贴敷组、针刺+贴敷组的TLR4、p-NF-κB蛋白表达阳性密度下降,Sirt1蛋白表达阳性密度升高(P<0.05),其中针刺+贴敷组蛋白表达阳性密度改变较针刺组及贴敷组显著(P<0.05)结论:1高血压前期患者以45-59岁男性多见,且吸烟、饮酒及嗜食高盐饮食患者也以该年龄段分布最多。高血压前期症状以目眩、头痛、口苦、头晕、懒言、舌淡胖、乏力最常见。病位证素脾最常见,病性证素痰湿最常见。高血压前期证型分为四类,脾虚痰湿,肝火亢盛,阴虚阳亢,气阴亏虚,其中脾虚痰湿证型所占比例最高。2电针结合中药灸贴可降低高血压前期大鼠血压,延缓心肌纤维化进程,改善预后,比单一针刺或中药灸贴作用显著。3电针结合中药灸贴可能通过调节Sirt1/TLR4/NF-κB信号通路,降低心肌组织巨噬细胞含量,减少IL-6,IL-1β,TNF-α释放,发挥延缓心肌纤维化的作用。