【摘 要】
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为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫对宿主细胞的入侵和损伤机制,及为抗球虫药物研究提供体外细胞模型。本研究从SPF鸡胚盲肠中分离并建立了鸡胚盲肠上皮细胞系。通过对细胞培养基中不同浓度生长因子的选择,同时利用光学和透射电子显微镜、细胞生长曲线、群体倍增时间、冻融前后细胞活力、上皮细胞标志蛋白的表达、染色体核型分析、同工酶检测、支原体检测及柔嫩艾美耳球虫侵染率等指标进行鸡胚盲肠上皮细胞系培养、鉴定及生物学特性的研
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31602029）；
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为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫对宿主细胞的入侵和损伤机制,及为抗球虫药物研究提供体外细胞模型。本研究从SPF鸡胚盲肠中分离并建立了鸡胚盲肠上皮细胞系。通过对细胞培养基中不同浓度生长因子的选择,同时利用光学和透射电子显微镜、细胞生长曲线、群体倍增时间、冻融前后细胞活力、上皮细胞标志蛋白的表达、染色体核型分析、同工酶检测、支原体检测及柔嫩艾美耳球虫侵染率等指标进行鸡胚盲肠上皮细胞系培养、鉴定及生物学特性的研究。试验结果表明:（1）鸡胚盲肠上皮细胞培养基生长因子的最佳添加浓度分别为胰岛素10μg/m L、氢化可的松1.5μg/m L、转铁蛋白5μg/m L、纤连蛋白1μg/m L。利用上述培养基对原代和传代细胞培养,成功地建立了鸡胚盲肠上皮细胞体外培养体系。（2）通过倒置显微镜对鸡胚盲肠上皮细胞形态学观察,发现原代鸡胚盲肠上皮细胞接种1 d后,隐窝细胞附着在培养板上,开始向外伸展出盲肠上皮细胞;2～3 d细胞之间界限清晰,连接紧密,呈典型的“铺路石样”形态;4～6 d细胞生长快速,多数细胞呈岛屿状生长;7～8 d细胞铺满培养板。连续传代至15代,岛屿状聚集的细胞逐渐减少。透射电子显微镜下观察到鸡胚盲肠上皮细胞标志性结构如微绒毛、紧密连接结构、桥粒等,同时线粒体和内质网形态良好。（3）通过MTT法测定细胞活力,绘制出原代、5代、10代和15代鸡胚盲肠上皮细胞的生长曲线,均呈典型的“S”型,细胞群体倍增时间为20.62 h,符合细胞一般生长规律。采用血清:DMSO为9:1作为冻存液结合梯度降温法将细胞冻存于液氮,复苏时将细胞于37℃水浴快速解冻,结果显示冻融前后细胞活力差异不显著（P＞0.05）,表明鸡胚盲肠上皮细胞具有良好的生物学特性。（4）利用免疫荧光染色法,对原代和第15代鸡胚盲肠上皮细胞角蛋白-18和E-钙粘蛋白进行染色,鉴定均为阳性。利用RT-PCR法,在5代、10代和15代鸡胚盲肠上皮细胞中均检测到上皮细胞角蛋白-18和E-钙粘蛋白基因的表达,表明培养细胞为上皮细胞。（5）染色体核型分析表明原代和第15代鸡胚盲肠上皮细胞均为二倍体核型,具有遗传稳定性。同工酶检测原代和第15代鸡胚盲肠上皮细胞与鸡巨噬细胞的苹果酸脱氢酶和核苷酸磷酸脱氢酶酶谱完全相同,且不存在其他杂带,表明该细胞与鸡巨噬细胞同种,并且不存在与其他细胞的交叉污染。支原体检测阴性,表明培养的鸡胚盲肠上皮细胞未受到支原体的污染。第15代鸡胚盲肠上皮细胞柔嫩艾美耳球虫的侵染率与原代细胞差异不显著（P＞0.05）,表明鸡胚盲肠上皮细胞系可作为球虫相关研究的体外培养模型。
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