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MicroRNAs(miRNAs)是一组小的单链非编码RNA分子,是重要的基因负调控因子。这种靶基因表达的转录后调控的关键,被认为是靶RNA的3’非翻译区(3’UTR)与miRNA的5’种子区(Seed Region)的不完全碱基互补结合。鉴于靶基因的多样性和,miRNA似乎与多种作为抑癌基因与癌基因的细胞信号转导通路的成分在功能上互相作用,而组合产生了一个复杂的网络。以miRNA表达谱来检视这些网络,揭示了在多种肿瘤中这些分子存在广泛的失调,这表明在肿瘤发生中miRNA发挥了关键的作用。短发夹RNA(shRNA)是一种新的RNA干扰(RNAi)调控体,其包含事先设计的由一个环状结构分隔的反义链和正义链组成。shRNA被认为在细胞中被加工成具备功能的形式,即在正义链作为“过客链”释放后,反义链作为“引导链”使RISC活化。shRNA可以用来拮抗异常表达的miRNA而抑制肿瘤。近来有报道利用慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)干预调节肿瘤中异常表达miRNA的功能,较之传统反义技术只能对于癌基因进行逐个且效率较低的干预具有明显的优势。但慢病毒载体存在诸多缺点,同时某类肿瘤具有多种异常表达miRNA,且存在结构相近的miRNA簇,而上述研究中shRNA仅是靶向某种特定的miRNA。Ciafre等以及我们的先期研究利用基因芯片的方法均显示,miR-221/222在胶质母细胞瘤中显著上调。我们前期在体内体外实验中均证实,利用反义寡核苷酸共抑制miR-221和miR-222来直接上调p27kip1可以明显抑制肿瘤细胞的增殖。本实验中,我们利用载体融合技术成功设计了一种腺病毒介导的shRNA,在胶质瘤中可以功能性地共抑制miR-221和miR-222的表达,这样就克服了上述靶向miRNA的基因治疗的种种不足,使多种肿瘤相关的miRNA可以同时进行调控,并避免了慢病毒载体的诸多缺点,有希望成为一种高效的基因治疗策略。此外,我们在上述shRNA基础上,合成了一种衍生的shRNA。这种shRNA的3’端碱基,即与靶miRNA的5’种子区配对的区域被突变,因而减低了与miRNA结合的稳定性。实时定量PCR结果显示应用经典型shRNA可以达到对miRNA表达水平的最大抑制效果,次之以突变型shRNA和空白对照,呈一个明显的梯度。miR-221/222的直接靶点p27kip1的蛋白表达水平及其对细胞周期G1期阻滞的效应和细胞凋亡也出现了与之相应的梯度式半定量改变。这样,同时利用经典型和突变型shRNA,我们就可能达到利用RNAi技术对多种肿瘤相关miRNA的表达和功能进行多层次半定量地调控。这也可以为我们深入探索miRNA在肿瘤发生中的作用和相应基因治疗提供了方法学的基础。