骨组织工程技术的发展为临床治疗骨缺损提供了新的途径,但间充质细胞、成骨细胞等传统种子细胞存在数量不足、扩增能力有限、容易衰老等问题。人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells,hi PSCs）具有无限自我更新和多向分化的潜能,并且避免了伦理问题,无疑是目前骨组织工程最理想的种子细胞来源。诸多小分子化合物或生长因子已被报道可以提高hi PSCs成骨分化效率,但是分化效率仍有待提高。除了生物化学调控,有必要利用生物材料来模拟细胞外基质,通过改善细胞微环境以促进细胞增殖和提高分化效率。其中,粗糙度已被广泛应用于调控间充质等普通干细胞的体外成骨分化。然而,hi PSCs的粘附需要特殊的表面修饰,这对细胞的感知能力和随后的粘附过程有很大的影响。因此,开发一种支持hi PSCs的粘附且粗糙度可调的修饰方法,研究培养表面粗糙度对hi PSCs体外行为的影响具有重要的研究意义。人工合成表面,尤其是多肽修饰的表面被认为是大规模培养hi PSCs的理想选择。课题组前期开发了聚多巴胺（Polydopamine,PDA）合成表面,接枝玻连蛋白来源的VN多肽后,可以维持hi PSCs自我更新20代以上。而且,课题组前期研究发现,升温和搅拌能够促进多巴胺的聚合,并且控制多巴胺聚合时间可以获得从纳米到亚微米粗糙度的聚多巴胺涂层。因此,以这些工作为基础,本研究拟在聚苯乙烯表面制备不同聚合时间的聚多巴胺涂层,经羧甲基壳聚糖和多肽修饰后,构建具有支持hi PSCs贴壁功能的粗糙多肽修饰涂层,研究表面粗糙度对hi PSCs体外贴壁、干性维持及成骨向诱导分化的真实影响。考虑到与广泛使用的Matrigel相比,现有多肽修饰表面的细胞粘附和自我更新性能仍有待提高,尤其是粗糙表面不利于干细胞贴壁的研究共识,本研究通过改变氨基酸序列开发性能更优越的新型多肽,为后续研究奠定基础。针对已报道的两条贴壁性能良好的含RGD序列的VN多肽（AcKGGPQVTRGDVFTMP）和BSP多肽（Ac-KGGNGEPRGDTYRAY）进行切割重组近D氨基酸序列,获得了NP1肽（Ac-KGGTYRAYRGDVFTMP）与NP2肽（Ac-KGGVFTMPRGDTYRAY）两条新肽。实验结果证实,与VN肽对照组相比,NP2肽具有更好的支持细胞贴壁和长期自我更新功能。抗体封闭实验证实NP2肽的受体主要为整合素αVβ3。进一步的石英晶体微天平定量测量结果证实,NP2肽较VN多肽具有更强的αVβ3受体亲和力。这些工作,为后续粗糙多肽修饰涂层的制备及调控细胞行为研究奠定了基础。使用课题组之前报道的方法,聚苯乙烯片置于60℃的多巴胺盐酸盐溶液中,在300 rpm下聚合不同时间（10 min,1 h,12 h和24 h）后,分别接枝羧甲基壳聚糖和NP2多肽。原子力显微镜表征结果证实成功获得纳米到亚微米粗糙度的聚多巴胺涂层及最终多肽修饰培养基底。水接触角测量显示各表面呈现相近的亲水性,以及FITC标记多肽定量测量证实多肽接枝量没有显著差异。进一步地,在不同粗糙度表面接种皮肤或尿液来源的hi PSCs（f-hi PSCs和u-hi PSCs）,CCK8和结晶紫的结果均显示亚微米粗糙表面（R=180 nm）不利于f-hi PSCs的贴壁增殖,而更易分化的u-hi PSCs并不能适应我们的表面培养。同时RT-PCR结果也显示,纳米粗糙表面（Ra=17 nm）上的f-hi PSCs的多能性基因表达上调,这表明低纳米粗糙表面有利于f-hi PSCs自我更新。进一步检测了贴壁相关基因,发现粗糙度可能通过调控FAK、Vinculin、E-Cadherin和MYH9基因来影响hi PSCs的贴壁和多能性。另外,我们选取两个粗糙度相差较大的表面（Ra值分别为6.4nm和180 nm）,探索了纳米和亚微米粗糙度对hi PSCs成骨分化的影响。茜素红染色显示低纳米粗糙表面（Ra=6.4 nm）更有利于成骨过程中的钙沉积。流式细胞术、RT-PCR以及免疫荧光结果也显示,低纳米粗糙表面（Ra=6.4 nm）更有利于hi PSCs成骨向分化。本课题研究了氨基酸序列对多肽性能的影响,获得的新型多肽序列具有良好的应用前景。更重要的,研究了多肽修饰表面粗糙度对hi PSCs体外生长及成骨分化的真实影响,后续将进一步研究相关分子机制。所得发现对于指导生物材料设计,提高hi PSCs成骨分化效率具有重要意义。