背景和目的雄激素脱发（Androgentic alopecia,AGA）是当今最为常见,发病率最高的脱发疾病。最新数据表明,AGA的发病人群日益年轻化,发病率逐年增高,给患者身心健康造成了不同程度的负担。虽然AGA的发病已经被公认是与雄激素,基因遗传等因素相关,但其具体的病理机制尚未阐释明确。目前针对AGA的治疗方法主要包括药物（FDA,Food and Drug Administration）批准的非那雄胺和米诺地尔)和植发手术,但有效率因人而异,且均存在一定的副作用和应用限制,无法有效地解决AGA带给患者的困扰。所以,AGA无论是在临床上还是在基础研究层面,无论是对于医生还是科研者们而言,都是一项巨大的挑战。基于此,深入阐释并明确AGA的发病机理,寻找新的治疗方法和有效靶点,成为了广大医学工作者的一项重要而迫切的任务。毛囊（hair follicle,HF）是由真皮成分和上皮成分共同构成,真皮成分的核心功能成分是位于毛球部的毛乳头（dermal papilla,DP）,作为毛囊生长的调控中心,DP能够周期性地分泌对毛囊生长至关重要的相关因子,通过真皮-表皮联系来调控上皮成分细胞的生物学功能。更为重要的是,既往研究已经证实,DP是AGA雄激素攻击的靶点部位,所以DP一直是AGA机制研究的核心和重点,大部分AGA研究都围绕DP展开。但与此同时,毛囊的上皮成分对于维持毛囊生物学功能也至关重要,其核心功能成分为位于毛囊隆突区（bulge）的毛囊干细胞（hair follicle stem cells,HFSCs）,它的功能异常将直接导致毛囊发育与形态的异常,是很多毛发疾病的基础。然而迄今为止,因为HFSCs体外培养的限制及临床组织的缺乏,对于AGA中HFSCs相关病理机制的探究少之又少。由此,我们旨在通过高通量测序技术,深入揭示毛囊内DP和HFSCs两种主要成分在AGA中的转录组学改变,从而全方面地探讨AGA中毛囊不同功能成分的分子病理机制,为AGA研究和治疗提供新的思路。MicroRNA（miRNA）是一种小的内源性非编码RNA分子,已被证实对于细胞各项生物学功能都具有重要的调控作用,针对miRNA的基因治疗也是当今医学领域极具潜力的发展方向之一。同样地,miRNA也被证实参与了毛囊的发育生长等各项生物学活动调控。那么在AGA的发病机制中,miRNA又起着怎样重要的调控作用?是否有望成为AGA特有的治疗靶点?目前为止,AGA中miRNA的作用及其调控网络的相关研究还处于较为空白的状态。因此,我们希望借助高通量测序技术,检测在AGA毛囊中DP和HFSCs两种主要成分中主要发挥作用的miRNA,并联合对应的转录组,初步构建AGA中mRNA-miRNA的共调控网络,一方面为今后深入研究AGA在miRNA层面的分子机制打下基础,另一方面也可以为AGA的治疗提供一些新的潜在的治疗靶点。方法1.毛囊的获取与显微分离本次实验所用的毛囊分别来自于12名AGA患者的前额脱发区和后枕非脱发区,以及12名正常志愿者的后枕区。患者均签署知情同意书。毛囊的钻取采用FUE（follicular unit extraction）技术,毛囊获取后即刻于体式镜下行显微分离,分别取以DP为核心的毛球部分（DP-containing part）,以及位于皮脂腺下部的HFSCs主要分布的隆突区（bulge-containing part）。由此,本实验的组别构成有以下6组:AGA脱发区毛囊毛球部,AGA脱发区毛囊隆突区,AGA非脱发区毛囊毛球部,AGA非脱发区毛囊隆突区,对照组毛囊毛球部,对照组毛囊隆突区。2.AGA毛囊不同部位的转录组学探究将获取的毛囊组织于Illumina HiSeq4000测序仪进行文库测序,对结果进行差异表达分析（Audic S算法）,同时我们设定错误发现率（False discovery rate,FDR）小于0.05且差异倍数|log2FC|大于等于1的为差异表达基因标准。根据不同组间差异基因的比较,并对差异基因进行GO及KEGG等功能分析,深入挖掘组间差异基因的可能的作用机制。最终,对于关键的差异功能基因进行qpcr及免疫荧光的验证。3.AGA毛囊不同部位的miRNA表达谱探究将同一批组织均分为2份,一份进行转录组测序后,另一份于Illumina Hiseq X Ten测序仪进行miRNA文库测序,同样采用Audic S算法进行差异表达分析,并设定错误发现率（False discovery rate,FDR）＜0.05且差异倍数|log2FC|≥ 1为差异表达miRNA标准。根据不同组间差异miRNA的分析和功能剖析来分析其在AGA中可能的调控机制。对于关键的miRNA进行原位杂交来明确其在毛囊的表达。4.AGA毛囊不同部位的mRNA-miRNA调控网络的建立基于以上mRNA测序及对应miRNA的测序结果,我们通过联合分析建立AGA毛囊不同部位相关的mRNA-miRNA分子调控网络。通过联合应用RNAhybrid和miRanda两个数据库,我们对同一组内表达趋势相反的差异基因与差异miRNA进行配对及预测,最终用Cytoscape对AGA毛囊不同部位的mRNA-miRNA调控网络进行可视化表达。结果1.AGA毛囊不同部位转录组基本功能分析通过对AGA脱发区,非脱发区,及正常人的毛囊DP和隆突区分别进行对比,我们初步鉴定了大量的差异表达基因。其中,我们发现大量炎症,应激,纤维化相关的基因在AGA毛囊的DP和隆突组都明显上调,大致呈现脱发区高于非脱发区、高于正常组的统一趋势,从而初步确立了 AGA的“炎症-应激-纤维化”的病理改变机制。2.AGA毛囊隆突区病理机制分析在AGA“炎症-应激-纤维化”的病理改变中,我们发现在隆突区组表达的与炎症,应激相关的上调基因数目要多于DP组,这说明了隆突区可能是AGA毛囊炎症浸润的主要部位。此外,我们比较了已证实的对于HFSCs稳态维持至关重要的相关信号分子在隆突区不同组间的表达情况,发现他们在AGA脱发区的隆突区都呈现异常表达,这充分说明在AGA中HFSCs的稳态出现了破坏,干细胞功能异常,而这极有可能与隆突区集中的炎症浸润相关。随后,我们运用qpcr检测关键的炎症,应激,纤维化相关基因的表达趋势,结果与转录本一致。此外,免疫荧光和WB也证实了 FOSB,PSORS1C2等炎症相关基因在AGA脱发区的DP和隆突区的高表达水平。3.AGA与银屑病（psoriasis）的关联最后,在对AGA不同部位的转录本分析中,我们发现很多差异显著的基因是psoriasis相关的致病基因,介于AGA被认为与很多疾病有关联,我们进一步通过network对AGA密切相关的差异基因与psoriasis相关的致病基因进行关联分析,结果确定了了 14个psoriasis相关的致病基因与5个AGA相关基因存在密切的互作关系.结果初步说明了 AGA与psoriasis的发病之间存在一定的关联。4.AGA毛囊不同部位相关的miRNA表达谱分析我们用同样的六个组别进行miRNA测序并进行基本的功能分析,结果证实大量与炎症相关的miRNA在AGA组的DP和隆突区都明显上调,如miR-146a/b,miR-21,miR-125b以及miR-150等,这与转录本的炎症基因上调的趋势一致。这再次印证了炎症浸润在AGA病理机制中的重要作用。为了印证炎症相关miRNA在AGA毛囊中的表达和作用,我们运用qpcr进行了验证,并通过原位杂交技术证实了具有高表达量的显著差异的炎症相关miRNA,miR-146b-5p,在AGA毛囊中的表达。结果证实miR-146b-5p在AGA脱发区毛囊的表达明显高于后枕非脱发区毛囊,并主要集中在bugle区外根鞘及毛母质相关部位。这说明了炎症相关miRNA在AGA的病理机制中的关键作用,有成为未来AGA治疗靶点的潜能。5.AGA毛囊不同部位mRNA-miRNA调控网络的建立我们通过联合分析AGA毛囊不同部位的转录本与miRNA表达谱,筛选有高度关联的mRNA-miRNA并构建network互作网络。结果发现在DP组的mRNA-miRNA调控网络里,与miRNA匹配的mRNA多集中于炎症相关的靶基因,如 FOS,FOSB,EGRs,ZBTB16,STK10,CDSN 等,均在 AGA 组中表达上调。而对于隆突组的mRNA-miRNA调控网络中,除了同样有上调的炎症,应激相关的靶基因被匹配到之外,大量下调组织结构相关的基因（黏附分子,细胞外基质合成,皮肤屏障）被预测到与miRNA存在调控关系。随后我们运用Pearson相关系数（Pearson Correlation Coefficient）计算后进一步证实了在AGA的隆突区,miRNA与许多组织结构相关的基因具有显著的联系。结果初步说明在AGA里,miRNA参与并抑制了毛囊隆突区组织结构相关的重要基因的表达,导致隆突区微环境的破坏,这可能直接导致HFSCs功能的异常。结论1.AGA毛囊存在“炎症-应激-纤维化”的基本病理机制改变,包括DP所在的毛球部和隆突区,其中,隆突区炎症相关的基因表达更多,是AGA毛囊炎症浸润的主要部位。2.AGA毛囊里HFSCs功能相关的信号分子表达异常,表示在AGA中,HFSCs的稳态破坏,功能异常。而这极有可能与隆突区的炎症浸润有不可分割的关系。3.AGA相关的基因与psoriasis致病基因之间有紧密的互作关系,一定程度上说明了 AGA与psoriasis之间的关联。4.miR-146a/b,miR-150,miR-21,miR-125b等炎症相关的miRNA在AGA的DP和隆突区表达明显上调,说明了炎症相关miRNA参与调控AGA的炎症活动。5.AGA的mRNA-miRNA网络构建证实了隆突区存在大量miRNA参与并抑制了组织结构相关的重要基因的表达,导致隆突区微环境的破坏,HFSCs功能的异常。