论文部分内容阅读
目的:疟疾是由疟原虫感染引起、通过雌性按蚊叮咬传播给人类的寄生虫病。大部分的疟疾感染是由致命的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum,P.f）和间日疟原虫（Plasmodium vivax,P.v）引起,后者分布范围更广,世界上约40%的人口面临间日疟原虫感染风险,在美洲、非洲和亚太地区造成了巨大的疾病负担。疟疾免疫应答中,固有免疫细胞树突状细胞（DCs）以及适应性免疫细胞T细胞、B细胞发挥着不可替代的作用。DCs是初次免疫应答过程中唯一的抗原提呈细胞,是激活T细胞免疫应答的重要细胞亚群,其表面表达的TLR分子识别不同类别的内源性或外源性核酸并启动适应性免疫反应。Na（?）ve T细胞活化后,在外周淋巴器官的T-B细胞区交界处与抗原激活的B细胞相互作用,之后分别成为GC B细胞和Tfh细胞,通过滤泡状树突细胞（FDC）的参与完成生发中心反应,之后T、B淋巴细胞分别分化为记忆T细胞和记忆B细胞。近年来,免疫检查点分子（ICM）之一的PD-1与人类疟疾有关,有研究报告称,PD-1可以介导P.yoelii YM的致死性。T-B细胞间的双向作用中PD-1与PDL1/PD-L2与共刺激信号在不同时相作用于T细胞或B细胞,从而促进或抑制Tfh细胞和B细胞的活化、迁移和分化,PD-1和PD-Ls结合能有效地抑制Tfh细胞的过度增殖。在体外实验中,PD-1+B细胞对CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖有明显的抑制作用氯喹（Chloroquine,CQ）和青蒿琥酯（Artesunate,AS）是抗疟治疗的一线药物,世界卫生组织（W.H.O）推荐使用AS作为治疗重症疟疾的第一选择,CQ用于大多数间日疟原虫和卵形疟原虫感染。除清除疟疾寄生虫效应外,最近研究发现,两种药物都具有一定的抗炎和免疫调节作用。然而,两种抗疟药如何调控疟疾感染中的免疫细胞、修饰免疫应答?对免疫检查点分子是什么样的作用?以及目前对免疫记忆细胞亚群的影响及其机制知之甚少。为此,本课题利用Plasmodium.chabaudi AS（P.c AS）感染C57BL/6小鼠为模型,系统观察两种抗疟药CQ和AS对免疫应答与免疫记忆的调节特点,进一步观察对免疫检查点分子尤其是PD-1/PD-L1调控,特别是探究了对免疫记忆的影响及影响免疫记忆建立的可能机制,旨在为有效抗疟治疗及抗疟药物的临床应用提供新的理论基础。方法:将雌性C57BL/6小鼠（6～8周龄）随机原则分为P.chabaudi感染组（P.c）、P.c感染青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）、P.c感染氯喹治疗组（P.c+CQ）;作为机制探讨部分分组为P.chabaudi感染组（P.c）、P.c感染氯喹治疗组（P.c+CQ）、P.c感染PD-1单克隆抗体阻断联合氯喹治疗组（P.c+PD-1m Ab+CQ）。P.c感染组C57BL/6小鼠腹腔免疫1×10~6P.c AS感染的红细胞;P.c+AS组在感染后2至4天,30mg/kg/d AS腹腔注射治疗;P.c+CQ组感染后2至4天,25mg/kg/d CQ腹腔注射治疗;P.c+PD-1m Ab+CQ组,分别于感染第0、3、5、7天应用PD-1m Ab阻断后在感染后2至4天25mg/kg/d CQ腹腔注射治疗;P.c感染组在相同时间点分别腹腔注射相同体积的PBS及等剂量PD-1m Ab同型对照。未感染的正常小鼠作为第0天对照。于感染后不同时间点进行尾静脉采血制备薄血涂片,Giemsa染色,动态监测红细胞感染率并对各组小鼠进行生存率观察。在不同时间点无菌取出小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,流式细胞仪测定脾脏中树突细胞（DCs）、经典树突状细胞（c DCs）和浆细胞样树突状细胞（p DCs）、活化的树突状细胞、表达Toll受体的树突状细胞、骨髓来源的抑制细胞（MDSCs）、调节T细胞（Treg）、活化T细胞、效应T细胞各亚群（Th1,Th2,Tfh细胞,GC Tfh细胞）、表达免疫检查点分子的CD4+T细胞（PD-1+CD4+T cells,LAG-3+CD4+T cells,TIGIT+CD4+T cells,TIM-3+CD4+T cells,CTLA-4+CD4+T cells,PD-1+LAG3+CD4+T cells,PD-1+TIM-3+CD4+T cells）,表达PD-1的B细胞（PD-1+B cells）、记忆T细胞亚群（TCM,TEM）、抗体分泌浆细胞、长、短寿浆细胞、记忆B细胞、Ig G1/Ig G2a类别转换记忆性B细胞、Ig G1/Ig G2a类别转换浆细胞亚群,ELISA方法测定脾脏培养上清中细胞因子水平及血清中特异性抗体的分泌。Western blot检测目标蛋白NF-κB p65,磷酸化Akt（p-Akt）的表达水平。结果:1、CQ/AS缩短了P.c AS感染进程。C57BL/6小鼠P.c感染后5-6 d,外周血中见疟原虫感染的红细胞,接着原虫血症快速上升,于11d至第一高峰,红细胞感染率约40%,第二高峰为感染后17d,红细胞感染率约30%;与P.c感染组相比,两给药组红细胞感染率曲线整体向右移,蒿琥酯治疗组（P.c+AS）于17d至第一高峰,红细胞感染率约40%,第二高峰为感染后21d,红细胞感染率约11.5%;氯喹治疗组（P.c+CQ）于19d至第一高峰,红细胞感染率约48%,第二高峰为感染后25d,红细胞感染率约27%。相较于蒿琥酯治疗组（P.c+AS）,氯喹治疗组（P.c+CQ）感染率峰值更晚出现,但氯喹治疗组（P.c+CQ）感染率第二高峰高于蒿琥酯治疗组（P.c+AS）（P＜0.05）。至原虫血症消退,观察期结束,感染组与给药组小鼠均未出现死亡。2、CQ/AS能够抑制P.c AS感染小鼠DCs增殖、活化。感染后第5天DCs、c DCs亚群升高水平在P.c感染组小鼠及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）未见显著差异,氯喹治疗组（P.c+CQ）显著降低;p DCs亚群升高水平在P.c感染组小鼠显著高于青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）,而氯喹治疗组（P.c+CQ）未出现升高。感染后第3天DCs表面CD86、PD-L1表达升高水平在P.c感染组小鼠及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）未见显著差异,氯喹治疗组（P.c+CQ）显著降低;感染后第5天DCs表面CD86、MHCⅡ表达升高水平在青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）显著低于P.c感染组,氯喹治疗组（P.c+CQ）未出现升高,显著低于P.c感染组小鼠及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）;DCs表面PD-L1表达升高水平在两给药组均显著低于P.c感染组。3、CQ明显降低P.c AS感染小鼠DCs表面TLR分子表达。感染后第3天,氯喹治疗组（P.c+CQ）DCs表面TLR4表达显著低于P.c感染组;感染后第5天,P.c感染组小鼠DCs表面TLR7、TLR9表达显著升高,青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）TLR7表达未出现升高,TLR9表达升高程度同P.c感染组,氯喹治疗组（P.c+CQ）与P.c感染组小鼠及青蒿琥酯治疗（P.c+AS）相比DCs表面TLR7、TLR9表达显著降低。4、CQ/AS显著降低P.c AS感染小鼠免疫调节细胞亚群的产生。与正常小鼠相比,在感染后第5天P.c感染组小鼠脾脏中MDSCs和Treg的比例显著升高,青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）MDSCs及Treg升高程度较P.c感染组降低,氯喹治疗组（P.c+CQ）MDSCs占比低于正常小鼠并低于P.c感染组及蒿琥酯治疗组（P.c+AS）,两给药组Treg升高程度均较P.c感染组降低。5、CQ抑制P.c AS感染小鼠Th1、Tfh细胞免疫应答。在感染后第5天P.c感染组及两给药组小鼠脾脏中活化T细胞均出现增加,Th1比例在P.c感染组及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）升高水平无显著差异;氯喹治疗组（P.c+CQ）Th1占比未出现增加,显著低于青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）。感染后第10天,三组小鼠Tfh升高水平无显著差异,GC Tfh在P.c感染组及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）出现升高,而氯喹治疗组（P.c+CQ）GC Tfh未出现升高,显著低于P.c感染组。感染后第20天,氯喹治疗组（P.c+CQ）Tfh及GC Tfh升高水平显著低于P.c感染组和青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）。6、CQ/AS对P.c AS感染小鼠脾培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-10的影响。在感染后第5天与正常小鼠相比,P.c感染组小鼠脾培养上清中IFN-γ、IL-6的分泌水平显著增加,青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）及氯喹治疗组（P.c+CQ）IFN-γ、IL-6分泌水平未出现增加,IL-10的产生在青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）显著增加,高于氯喹治疗组（P.c+CQ）,IL-1β产生在三组均未见明显差异。7、CQ/AS对P.c AS感染小鼠T、B细胞ICM表达的影响。与正常小鼠相比,在感染后第5天,P.c感染组、青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）及氯喹治疗组（P.c+CQ）小鼠脾脏中表达PD-1、LAG-3、TIGIT、TIM-3和CTLA-4的CD4+T细胞比例均出现显著升高,氯喹治疗组（P.c+CQ）表达PD-1的CD4+T细胞升高程度显著高于P.c感染组及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）,同时双表达免疫检查点分子的PD-1+LAG-3+CD4+T细胞、PD-1+TIM-3+CD4+T细胞在氯喹治疗组（P.c+CQ）出现显著升高。氯喹治疗组（P.c+CQ）Th1、Th2细胞亚群PD-1的表达显著高于青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）。在感染后第10天,氯喹治疗组（P.c+CQ）表达PD-1的B细胞显著高于P.c感染组及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）。8、CQ/AS对P.c AS感染小鼠抗体分泌浆细胞及抗体分泌水平的影响。与正常小鼠相比,在感染后第10天、第20天三组间抗体分泌浆细胞均出现增加,感染后第10天,两给药组抗体分泌浆细胞增加水平均低于P.c感染组,第20天氯喹治疗组（P.c+CQ）显著低于P.c感染组及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）。感染后第10天,P.c感染组血清总抗体Ig G、抗体亚类Ig G1和Ig G2a、抗AMA1抗体、抗MSP-119抗体表达水平显著升高;青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）抗AMA1抗体在感染后第10天未出现增加,显著低于P.c感染组,氯喹治疗组（P.c+CQ）抗AMA1抗体、抗MSP-119抗体在感染后第10天未出现增加,显著低于P.c感染组。感染后第20天,三组小鼠血清总抗体Ig G、特异性抗体抗AMA1抗体、抗MSP-119抗体表达水平均出现显著升高,组间未见显著差异。9、CQ/AS对P.c AS感染小鼠记忆T细胞的影响。与正常小鼠相比,在感染后第10天,P.c感染组小鼠脾脏CD4+T细胞中TCM细胞比例显著升高,两给药组未升高,组间无显著差异;P.c感染组及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）小鼠脾脏CD4+T细胞中TEM细胞比例增加,氯喹治疗组（P.c+CQ）未出现增加,显著低于P.c感染组及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）。10、CQ/AS对P.c AS感染小鼠记忆性体液免疫应答细胞的影响。与正常小鼠相比,感染后第10天P.c感染组及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）MBC升高水平无显著差异,氯喹治疗组（P.c+CQ）MBC升高水平显著低于P.c感染组;感染后第15天青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）MBC升高水平显著低于P.c感染组,氯喹治疗组（P.c+CQ）未出现升高。感染后第20天,P.c感染组及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）长寿浆细胞升高水平未见显著差异,氯喹治疗组（P.c+CQ）长寿浆细胞比例显著降低,短寿浆细胞比例显著高于P.c感染组及青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）。感染后第10天,P.c感染组Ig G1/Ig G2a类别转换记忆性B细胞、Ig G1/Ig G2a类别转换浆细胞比例显著升高,青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）Ig G2a类别转换记忆性B细胞及Ig G1类别转换浆细胞比例显著升高,Ig G1类别转换记忆性B细胞及Ig G2a类别转换浆细胞升高程度显著低于P.c感染组,氯喹治疗组（P.c+CQ）Ig G1/Ig G2a类别转换记忆性B细胞、Ig G1/Ig G2a类别转换浆细胞均未出现升高,显著低于P.c感染组,其中Ig G1类别转换浆细胞同时显著低于青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）。11、CQ通过NF-κB/Akt及PD-1/PD-L1通路影响免疫记忆。为了进一步探讨氯喹调控免疫记忆细胞的分子机制,我们分别进行了蛋白免疫印迹（Western blot）实验及PD-1单抗阻断实验以验证。Western blot结果显示在感染后第3天和第5天,P.c感染组小鼠脾细胞总蛋白中NF-κB及磷酸化Akt蛋白表达明显增加,与P.c感染组相比青蒿琥酯治疗组（P.c+AS）在感染后第3天磷酸化Akt蛋白表达降低,氯喹治疗组（P.c+CQ）在感染后第3天和第5天NF-κB及磷酸化Akt蛋白显均显著降低。PD-1单抗阻断后的感染小鼠给予氯喹治疗（P.c+PD-1m Ab+CQ）,在感染后第10天对小鼠脾脏中的记忆细胞亚群进行检测,与P.c感染组相比CD4+TEM、MBC、Ig G2a类别转换记忆性B细胞所占比例未出现降低,与氯喹治疗组（P.c+CQ）相比Ig G2a类别转换记忆性B细胞显著升高。结论:1、与AS相比,CQ对DCs的成熟、活化和分化抑制作用更显著。2、与AS相比,CQ对MDSCs的抑制作用更显著。3、CQ上调CD4+T细胞及B细胞表面PD-1的表达。4、与AS相比,CQ对免疫记忆细胞亚群的抑制作用更显著。5、CQ通过NF-κB/Akt及PD-1/PD-L1通路调控免疫记忆,且相较于血清抗体产生而言,免疫记忆细胞对于CQ的抑制作用体现为更敏感的指标。