目的:目前报道的恶性肿瘤中,肺癌的死亡率位居首位。寻找肺腺癌（LUAD）中的表达差异分子,并研究其致癌的分子机制能够成为肿瘤检测和靶向治疗的基础。ARHGEF16是一种Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子,主要调控GDP交换GTP激活Rho GTPases,影响重要的生物过程。最早研究发现ARHGEF16可以促进未转化的小鼠成纤维细胞NIH3T3发生恶性转化,当使用ROCK抑制剂Y-27632后能够抑制这种转化能力。ARHGEF16也能够通过病毒蛋白HPV16 E6介导CDC42的激活。抗失巢凋亡被认为与肿瘤侵袭和转移有很大关系,研究发现在Hela细胞和MCF7细胞中敲低ARHGEF16后增加了细胞的凋亡数量,与增殖相关的PI3K和AKT水平显著下降。已有研究报道在乳腺癌、胶质瘤和结肠癌中ARHGEF16作为癌基因与其它蛋白相互作用促进肿瘤的恶性进展。在乳腺癌中ARHGEF16与受体Eph A2相互作用能够激活Rho G,进而在细胞膜上形成复合物介导Rac的激活,促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭行为。在胶质瘤中发现GLI2能够上调ARHGEF16的转录水平,而ARHGEF16的上调促进了胶质瘤细胞的恶性表型。在结肠癌组织中ARHGEF16呈高表达,ARHGEF16与非受体酪氨酸激酶FYN共同促进了结肠癌细胞的恶性进展。相反,通过黑色素瘤细胞转录组数据以及实时定量PCR实验证实ARHGEF16可能是候选的肿瘤抑制基因,可能与ARHGEF16启动子甲基化导致的转录失活有关。目前ARHGEF16在LUAD中扮演的角色以及在肿瘤进展涉及的致癌机制未见报道。有学者研究发现斑马鱼视神经损伤后视网膜内的Wnt5b m RNA升高、Wnt10a m RNA和ARHGEF16 m RNA下降,这些分子的表达变化趋势与细胞核内β-catenin的下调有关。基于此现象我们猜测在LUAD中ARHGEF16可能通过Wnt信号通路的致癌机制发挥作用。免疫组化染色评估ARHGEF16在LUAD组织切片中的表达,蛋白免疫印迹检测LUAD和癌旁组织中ARHGEF16蛋白的表达。通过转染质粒ARHGEF16（p-ARHGEF16）和si RNAARHGEF16（si ARHGEF16）,观察细胞功能学变化和Western blot检测Wnt信号通路关键蛋白的变化。抑制剂XAV-939用来验证Wnt信号通路的激活是由ARHGEF16过表达所介导的。研究方法:1、临床组织标本:123例非小细胞肺癌（NSCLC）石蜡组织标本,其中包括75例LUAD,来自于承德医学院附属医院病理科资料库。同时收集了配对的42例癌旁肺组织石蜡包埋块。此外还收集了6对新鲜肺腺癌组织和癌旁组织,通过Western blot检测ARHGEF16蛋白在两组间的表达差异。2、免疫组织化学（IHC）:中性福尔马林固定的NSCLC组织和配对癌旁组织石蜡包埋块,按照IHC试剂盒说明书对NSCLC组织进行染色,并分析ARHGEF16表达与临床病理特征的相关性。3、数据库分析:通过GEPIA和Oncomine数据库分析ARHGEF16在NSCLC组织中的转录水平。c Bio Portal数据库了解LUAD中ARHGEF16的突变类型和频率。Kaplan-Meier数据库通过整合ARHGEF16在LUAD中的表达与预后价值进行分析。4、细胞培养和转染:培养的5种NSCLC细胞系（H1975、A549、H1299、SK-MES-1以及H460）和正常人支气管上皮细胞系（HBE）用来比较内源性ARHGEF16的蛋白水平。最后确定利用lipo3000在H1299和A549细胞系中转染p-ARHGEF16、在H1975和A549细胞中转染si ARHGEF16,然后进行后续的细胞功能实验和蛋白质检测。5、细胞免疫荧光:将接种于24孔板中的H1299和A549细胞与ARHGEF16抗体孵育,观察ARHGEF16在细胞系中的亚细胞定位。将24孔板中转染p-ARHGEF16的H1299细胞和转染si ARHGEF16的A549细胞,与β-catenin抗体结合过夜,第二天二抗孵育2 h并用DAPI染细胞核,观察ARHGEF16调控β-catenin的入核情况。6、CCK-8和克隆形成实验:转染p-ARHGEF16后,观察过表达ARHGEF16对H1299和A549细胞增殖的作用。转染si ARHGEF16检测敲减ARHGEF16后对H1975和A549细胞增殖的影响。7、细胞划痕:通过在A549细胞中转染p-ARHGEF16 24h或si ARHGEF16 36h后,检测划痕后细胞的愈合能力。Transwell迁移实验:在H1299和A549细胞中转染p-ARHGEF16 24 h后检测ARHGEF16对细胞迁移的影响,在H1975和A549细胞中转染si ARHGEF16 36 h后,分析迁移细胞数目的变化。在H1299细胞中过表达ARHGEF16和A549细胞敲低ARHGEF16通过铺胶侵袭实验检测细胞的侵袭能力。8、流式细胞实验:H1299过表达ARHGEF16或者A549敲低ARHGEF16后,检测细胞周期进程的变化。细胞凋亡:H1299过表达ARHGEF16或者A549敲低ARHGEF16后,观察细胞凋亡率的变化。9、Western blot:首先检测新鲜LUAD和配对癌旁肺组织中ARHGEF16的表达水平。通过p-ARHGEF16转染H1299和A549细胞或者si ARHGEF16转染H1975和A549细胞后,检测Wnt信号通路关键蛋白的变化。同时检测EMT表型蛋白、细胞周期和凋亡相关蛋白以及迁移相关蛋白的变化。10、蛋白核浆分离:H1299过表达ARHGEF16或者A549敲低ARHGEF16后,分别提取细胞核、浆蛋白,通过Western blot检测β-catenin蛋白在细胞核、浆内的表达变化。11、抑制剂实验:使用XAV-939抑制Wnt信号通路活性,即在H1299和A549细胞中转染p-ARHGEF16 36小时后,将XAV-939加入细胞中孵育12小时。通过细胞功能实验检测细胞增殖、迁移的改变以及Western blot检测Wnt信号通路蛋白磷酸化GSK-3β（ser9）、活化的β-catenin以及靶蛋白c-Myc、Cyclin D1和MMP-7的改变。12、q RT-PCR实验:H1299细胞过表达ARHGEF16或者H1975敲低ARHGEF16后24 h提取RNA,再反转录成c DNA,经过PCR扩增反应,检测调控ARHGEF16后是否影响GSK-3β、β-catenin和Snail的m RNA水平。结果:1、组织水平Western blot发现与癌旁组织相比,ARHGEF16在LUAD中高表达。免疫组化染色发现ARHGEF16高表达与LUAD的肿瘤大小、淋巴结转移和p-TNM分期呈正相关。Kaplan-Meier数据库发现LUAD中ARHGEF16高表达患者组预后差。c Bio Portal数据库发现LUAD中ARHGEF16突变以错义突变为主。2、CCK-8和克隆形成实验表明过表达ARHGEF16增强了H1299和A549的细胞活力和克隆形成能力,反之在H1975和A549细胞中敲低ARHGEF16后减弱了它们的细胞活力和克隆形成能力。3、转染质粒ARHGEF16后,H1299和A549细胞的迁移能力以及H1299细胞的侵袭能力增强,反之转染si ARHGEF16后H1975和A549细胞迁移能力以及A549细胞的侵袭能力减弱。Western blot检测迁移相关蛋白的实验中,发现过表达ARHGEF16后Rho B、Rho C、Rac1和CDC42表达水平升高,Rho A表达无统计学意义,反之敲减ARHGEF16后则出现相反的结果。4、细胞周期实验发现在转染H1299过表达ARHGEF16后S期细胞比例升高,G1期比例降低;同时Western blot检测相关蛋白发现H1299细胞中CDK2、CDK4和Cyclin D1表达升高。相反转染A549细胞敲低ARHGEF16后S期细胞比例降低,G1期比例升高,Western blot检测A549细胞敲低ARHGEF16后,CDK2、CDK4和Cyclin D1表达降低。我们还发现与对照组相比在H1299和A549细胞中转染ARHGEF16后细胞凋亡率无统计学意义。5、Western blot结果发现在H1299和A549过表达ARHGEF16后,Wnt信号通路中磷酸化GSK-3β（ser9）和活化的β-catenin以及它们的下游靶蛋白c-Myc、Cyclin D1和MMP-7的蛋白表达水平均上调。相反在H1975和A549细胞中敲低ARHGEF16表达后,上述指标的表达出现相反的结果。在EMT进程中,过表达ARHGEF16后,间充质表型分子N-cadherin、Snail和Slug蛋白水平升高,而上皮表型分子E-cadherin蛋白水平降低。相反敲低ARHGEF16处理的H1975和A549细胞,间充质表型蛋白N-cadherin、Snail和Slug水平降低,上皮表型分子E-cadherin水平升高,这一结果提示ARHGEF16作为潜在的促癌标志物激活了Wnt信号通路以及改变了EMT进程。6、通过在H1299细胞过表达ARHGEF16后,与对照组相比细胞核内β-catenin水平升高。相反在A549细胞借助si RNA外源性干扰ARHGEF16后,细胞核内β-catenin水平降低。7、我们在转染p-ARHGEF16的H1299和A549细胞中与Wnt信号通路抑制剂XAV-939孵育后,与加入DMSO组比较,活化的β-catenin、磷酸化GSK-3β（ser9）以及下游分子c-Myc、Cyclin D1和MMP-7蛋白水平明显降低。在细胞功能实验中,我们也观察到XAV-939抑制了A549和H1299细胞的增殖和迁移,逆转了ARHGEF16过表达所造成的影响。这些相互作用表明,XAV-939可逆转ARHGEF16过表达引起的Wnt信号通路关键蛋白水平的升高。8、我们发现在H1299细胞中过表达ARHGEF16后GSK-3β、β-catenin和Snail转录水平均上调,在H1975细胞中敲低ARHGEF16后,他们三者的转录水平降低。因此我们推定双向调控ARHGEF16后会影响GSK-3β、β-catenin和Snail的转录活性,进而影响Wnt信号通路的活性。结论:1.在LUAD组织以及细胞系中ARHGEF16均呈高表达,这与LUAD的不良预后以及病理特征相关;2.通过转染质粒和si RNA的手段调控ARHGEF16的表达后,细胞功能学和Western blot蛋白检测发现ARHGEF16能够促进LUAD细胞的增殖、侵袭和迁移;3.通过细胞流式周期实验和Western blot结果检测发现ARHGEF16能够调控LUAD细胞的周期进程,促进G1/S期转化;4、Western blot和q RT-PCR结果显示ARHGEF16能够正向调控Wnt信号通路和EMT的活性,促进LUAD的恶性进展。