口蹄疫是当前危害偶蹄动物的重要传染病,为了有效防控消灭该病,各国采取了不同措施,其中主要措施之一就是使用疫苗免疫,因此,研制安全、有效的疫苗成为各国研究者不懈追求的目标。我们实验室成功的构建了猪口蹄疫灭活疫苗制苗毒株OZK/93的感染性克隆及其L蛋白编码基因缺失的感染性克隆,拯救出了L蛋白缺失的基因工程致弱毒株,虽然该弱毒株比传统致弱毒株安全,但无法进行感染与免疫的鉴别诊断。为了进一步利用已经构建成功的缺失前导蛋白酶(Lpro)的口蹄疫病毒cDNA感染性克隆,本研究从两方面对该感染性克隆进行了修饰,为口蹄疫疫苗研发提供了新的途径。一方面通过插入外源基因,构建了一株能够表达外源基因的口蹄疫基因缺失弱毒疫苗毒株。其策略是在口蹄疫病毒基因组的非结构蛋白2A和2B之间插入一段编码荧光蛋白eGFP并带2A的外源基因,构建的相关基因排列顺序为-2A-eGFP-2A-2B-,构建成的感染性克隆命名为p43-CHA90-LL-eGFP2A。其质粒或体外体外转录转染细胞,连续传代后,发现原代转染细胞可以表达外源蛋白,细胞呈现绿色荧光并出现明显的CPE现象,收获病毒液进行传代后,绿色荧光消失,但CPE现象仍旧明显,表明病毒存活,但外源基因不表达,拯救病毒的RT-PCR产物测序结果显示eGFP-2A基因丢失。试验结果表明外源基因可以成功地插入基因组并转录产物,但嵌合基因组在复制过程或子代病毒在装配过程中利用某种未知机制很快将外源基因剔除,外源基因不能稳定遗传。因此,在外源基因剔除机制尚未清楚的情况下,在2A和2B之间插入外源基因来开发双价苗或联苗的策略值得商榷。另一方面根据口蹄疫病毒结构蛋白替换其抗原性随即发生改变的原理。在Lpro基因缺失病毒的基础上,删除自身结构蛋白VP1、VP2、VP3的编码序列,插入多克隆位点SspI、SgrAI,成功构建了口蹄疫病毒载体LL-Vector。我们进一步成功的将O型口蹄疫猪源流行毒株的VP1、VP2、VP3的编码序列插入到多克隆位点中,通过细胞转染、传代,发现有明显的CPE,证明病毒拯救成功。该毒株是一株基因工程缺失毒株,同时含有流行毒株主要抗原编码基因,表达与流行毒株一致的抗原性,从而为进一步研制口蹄疫安全制苗种毒提供了一种新型术路线。