论文部分内容阅读
乳脂是一种富含多种不饱和脂肪酸的油脂,其脂肪酸多以甘油三酯形态存在,过多的摄入甘油三酯会对人体健康有不利影响,容易引起高血压等一系列心脑血管疾病。现有研究表明,含有一定比例1,3-甘油二酯(1,3-DAG)的混合油脂,具有降血脂的功能作用。本文在建立一种高效液相方法检测乳脂中1,3甘油二酯含量的基础上,开发了一种在无溶剂体系下使用诺维信435酶(Novozyme 435)催化乳脂甘油解反应,制备富含1,3-甘油二酯改性乳脂的工艺。通过Caco-2细胞模型对改性乳脂在小肠吸收路径中相关代谢基因表达的影响进行探究,为改性乳脂产品功能性做出验证。建立了一种检测混合酯中1,3-甘油二酯含量的检测方法。通过高效液相(HPLC)色谱串联示差检测器对乳脂中1,3-甘油二酯进行分离检测,结果表明,流动相采用正己烷/异丙醇/甲酸(20:3:1),进样体积10uL,色谱柱柱温35℃,历时28min,可有效分离样品中不同甘油酯。通过面积归一化法进行定量,方法重现性试验RSD在0.468%~1.462%之间,稳定性试验RSD小于2%,回收率97.4%~101.3%之间。此方法高效、准确,适合用于富含1,3-甘油二酯混合酯的检测分析。开发了一种在无溶剂体系下使用Novozyme 435催化乳脂甘油解反应制备富含1,3-甘油二酯改性乳脂的工艺。从三种脂肪酶中选取Novozyme 435作为催化剂,考察反应时间、反应温度、酶添加量以及甘油乳脂摩尔比四种因素对1,3-甘油二酯得率的影响。单因素试验结果采用Box-Behnken试验设计进行优化并验证,获得最佳工艺参数为:在反应时间12.2h、酶添加量为6%,反应温度为54.6℃,醇油摩尔比3.6:1,甘油解反应后的乳脂产物中1,3-甘油二酯的含量可达48.72%。改性后的乳脂相关理化指标均符合国家相关质量和卫生标准。通过Caco-2细胞模型,考察富含1,3-甘油二酯的乳脂在肠道内转运过程中对相关基因表达的影响。稳定性试验显示改性前后的乳脂消化液能在12h内稳定存在于细胞培养液中。MTT细胞毒性实验显示改性乳脂消化液对Caco-2细胞的IC50值为1560?M,普通乳脂消化液的IC50值为1617?M,细胞试验控制在安全剂量水平下实施。21日龄细胞添加普通乳脂消化液(TAG)、改性乳脂消化液(DAG)、空白培养液(CK)在6孔板中共同培养4h后,采用实时荧光定量PCR技术对脂类小肠转运相关基因(FABP1、MTP、DGAT1、PPARα)的表达量进行测定。结果显示,DAG组和TAG组都能显著上调四种基因的表达,DAG组相对TG组极显著上调了FABP基因表达,而显著下调了MTP和DGAT1的表达(P<0.01),而PPAR?基因的表达量两组间无显著差异。提示改性乳脂与普通乳脂在小肠转运过程中存在差异,仅有少部分改性乳脂是通过2-单甘酯途径形成乳糜后进入血液的。结合本课题组之前在SD大鼠模型中所做研究结果,推测改性乳脂是通过3-磷酸甘油醛途径进行吸收转运的。