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髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和Tollip(Toll-interacting protein)均为哺乳动物天然免疫TLR/IL-1R通路中关键的信号传导分子,在免疫应答过程中发挥重要作用。本文首次克隆了日本鳗鲡(Anguilla japonica)MyD88和Tollip基因cDNA全长序列,分别命名为AjMyD88和AjTollip。其中AjMyD88基因全长为1774 bp,开放阅读框为846 bp,编码282个氨基酸。该蛋白三维空间结构图与人类MyD88十分相似,具有MyD88家族典型的死亡结构域和TIR(Toll-like/IL-1 receptor)结构域,其中TIR结构域中含有3个序列高度保守的box1、box2和box3。同源性分析显示AjMyD88氨基酸序列与斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)一致性最高,为75%,与其他鱼类一致性在68%~73%之间。系统发育树表明AjMyD88与其他鱼类MyD88聚为一支,而哺乳类以及两栖类MyD88分别聚为一支。AjTollip cDNA全长为1313 bp,开放阅读框为828 bp,编码276个氨基酸。该蛋白三维丝带空间结构图与人类的Tollip十分相似,具有氨基酸序列高度保守的典型TBD结构域,C2结构域以及CUE结构域。AjTollip与大西洋鲑Tollip蛋白氨基酸序列一致性最高,达92%。系统发育树表明:AjTollip与其他鱼类Tollip聚为一支,哺乳类及两栖类Tollip各为一支。实时荧光定量PCR结果表明:AjMyD88和AjTollip基因在日本鳗鲡各组织中均有表达,其中AjMyD88在脾脏、AjTollip在血细胞中表达量最高,而心脏和肌肉的基因表达水平均相对较低。日本鳗鲡经LPS、poly I:C、嗜水气单胞菌刺激后,对其肾脏、肝脏、脾脏以及血细胞中AjMyD88和AjTollip基因在不同时相的表达谱变化进行了研究。结果发现:LPS刺激后,AjMyD88基因肾脏、肝脏、脾脏中的表达水平均有明显升高,在血细胞中表达量则有不同程度下调。而在polyI:C免疫注射后6 h至48 h在以上四种组织的表达水平均有显著升高,但在肾脏刺激72 h则有明显降低。嗜水气单胞菌感染后,AjMyD88基因在肝脏、脾脏和血细胞中明显上调,在肾脏中明显下调;AjTollip基因表达水平经LPS刺激后在肝脏、肾脏显著上升,在脾脏无明显变化,在血细胞中显著下调。Poly I:C免疫注射后肾脏和肝脏中的表达量明显升高,但在脾脏和血细胞中则明显降低。嗜水气单胞菌感染后AjTollip基因表达量在肾脏和肝脏显著上升,但在血细胞中则明显下降。另外,脾脏刺激12 h有显著降低,但在72 h显著升高。经LPS、poly I:C、CPG、PGN以及三种不同浓度嗜水气单胞菌刺激后,日本鳗鲡肝脏细胞系AjMyD88和AjTollip基因表达水平变化如下:LPS刺激后AjMyD88表达量无明显变化,而poly I:C、CPG、PGN均能显著诱导AjMyD88表达水平升高。三种不同浓度嗜水气单胞菌诱导72 h后,AjMyD88表达量均有显著提高,但高浓度的10~7 cfu/mL和10~8 cfu/mL菌液刺激3h后其表达量则极显著降低;日本鳗鲡肝脏细胞系AjTollip基因表达水平在LPS、poly I:C、CPG和PGN刺激后均发现显著上调。三种菌浓度刺激后3 h至12 h,AjTollip表达量均显著升高,但高浓度的10~8 cfu/mL菌液刺激后24 h至48 h表达水平则显著降低。通过绿色荧光蛋白融合基因表达载体pEGFP-N1-AjMyD88和pEGFP-N1-AjTollip转染HEK-293T细胞,经LPS和poly I:C刺激后,人类TNF-α、MXA以及IL6基因表达水平变化如下:AjMyD88在HEK-293T细胞过表达后,能够明显提升LPS诱导IL6和MXA的表达水平,同样也显著增强poly I:C刺激TNF-α和IL6表达量的升高;AjTollip过表达后,对LPS诱导MXA的表达水平有明显的提升作用,且显著增强poly I:C对TNF-α、MXA以及IL6基因的诱导表达。以上结果表明AjMyD88和AjTollip是日本鳗鲡TLR/IL-1R通路中重要的信号转导和调节分子,参与了机体抵御外源致病菌以及病毒感染的免疫应答反应。