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背景人口老龄化是世界各国普遍存在的问题,对各社会领域都产生了巨大影响,成为二十一世纪最重要的挑战之一,因此研究衰老机制,寻找相应干预靶点对于应对人口老龄化尤为重要。细胞衰老是机体衰老的基础,而细胞衰老的机制到目前为止仍不清楚。核蛋白高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1,HMGB1）,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中快速迁移的特征而得名。它在正常情况下存在于细胞核内,在一定条件下分泌到细胞外进一步发挥作用。但关于HMGB1在衰老过程中的变化未有定论。关于HMGB1对衰老的影响也鲜有报道。越来越多的研究表明,随着年龄的不断增长,自噬功能不断下降,提高自噬能够延缓衰老。近年来,在细胞中普遍存在的HMGB1已被证明能够调控自噬。那么,我们有理由猜测HMGB1可以通过调控自噬影响衰老。为了明确上述问题,我们分别采用复制性衰老细胞模型和D-半乳糖（D?galactose,D-gal）诱导的衰老细胞模型,观察了HMGB1在细胞衰老过程中的变化,从自噬的角度研究了HMGB1对细胞衰老的作用及机制,并在动物实验上进行了进一步的观察验证,为抗衰老策略提供新的研究方向和思路。目的通过建立人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）复制性衰老和D-gal诱导细胞衰老模型,研究HMGB1在细胞衰老过程中的变化和对衰老的作用及机制,并且在动物实验中进行验证。方法1.细胞衰老模型:取15代HUVEC细胞作为年轻细胞,常规传代培养至50代作为衰老细胞。D-gal诱导衰老模型:取15代HUVEC细胞,加入不同浓度D-gal溶液处理以及处理不同时间,建立D-gal诱导的细胞衰老模型。通过感染慢病毒过表达HMGB1和HMGB1分泌抑制剂丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate,EP）调控HMGB1的水平,来研究HMGB1对衰老的作用及机制。2.动物衰老模型:取3月龄大鼠,设对照组,给予D-gal腹腔注射8周,建立Dgal诱导的大鼠衰老模型,同时给予HMGB1分泌抑制剂EP作为干预,研究HMGB1在衰老中的作用及机制。3.衰老相关β-半乳糖苷酶染色和活性分别采用试剂盒进行检测。4.细胞增殖能力采用CCK-8试剂盒进行检测。5.细胞培养基上清及动物血清中HMGB1含量采用ELISA试剂盒检测。6.细胞周期抑制蛋白p21、p27的m RNA水平采用Q-PCR方法进行检测。7.细胞周期抑制蛋白p21、p27蛋白水平,自噬相关分子LC3、p62、Beclin1、Atg7蛋白水平,以及HMGB1胞核胞浆蛋白水平等均采用Western Blot方法进行检测。8.MDA和AGEs含量,SOD和CAT活性等采用相应的试剂盒进行检测。结果1.HUVEC细胞在衰老过程中胞内HMGB1减少,胞外HMGB1增多。HUVEC细胞常规传代至50代后,SA-β-gal染色增加,活性增强,细胞增殖能力降低,p21、p27的m RNA水平和蛋白水平均升高,表明细胞已进入衰老状态。Western Blot结果表明,衰老细胞总HMGB1、胞浆HMGB1、胞核HMGB1蛋白水平均显著降低。ELISA结果显示衰老细胞培养基上清液HMGB1含量显著升高。SA-β-gal染色和Western Blot检测p21蛋白水平的结果表明,10 g/L D-gal处理72小时可以诱导HUVEC细胞衰老,在此过程中,细胞总HMGB1显著降低。2.HMGB1过表达能够增强自噬,延缓HUVEC细胞衰老。SA-β-gal染色和Western Blot结果显示,过表达HMGB1可以显著降低SA-β-gal和p21蛋白水平,表明在复制性衰老和D-gal诱导衰老过程中,HMGB1过表达能够改善细胞衰老相关指标。Western Blot结果表明,在复制性衰老和D-gal诱导衰老过程中,HMGB1过表达细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ水平升高,p62水平降低,表明过表达HMGB1能够提高自噬水平,缓解复制性衰老和D-gal诱导的细胞衰老。3.抑制HMGB1分泌能够提高D-gal所抑制的细胞自噬水平,并延缓D-gal诱导HUVEC细胞衰老。SA-β-gal染色和Western Blot检测发现HMGB1分泌抑制剂EP能够抑制SA-β-gal活性,抑制p21、p27表达水平,表明抑制HMGB1分泌能够延缓D-gal诱导的细胞衰老。Western Blot检测结果显示,EP处理能够提高自噬相关蛋白LC3-Ⅱ水平,降低p62水平,表明EP处理能够提高细胞在D-gal诱导衰老过程中的自噬水平。4.抑制HMGB1分泌能够延缓D-gal诱导的动物衰老,提高自噬水平。EP能够抑制D-gal引起的实验动物的血清中HMGB1、MDA和AGEs水平升高,降低肝脏中SA-β-gal活性、MDA水平,提高肝脏自噬水平,延缓D-gal诱导的实验动物的衰老。结论1.在细胞衰老过程中,胞内HMGB1降低,胞外HMGB1升高。2.过表达HMGB1或抑制其分泌,提高核内HMGB1水平,可以提高自噬水平,延缓衰老。