1.背景与目的:血管内皮受损是粥样硬化斑块形成的始动因素,也是血管损伤后不良修复反应的主要原因之一。长期以来,传统观念认为血管内膜损伤后内皮修复只有依靠损伤血管内膜边缘的内皮细胞(endothelial cell, EC)参与再生。近年来,实践证明邻近参与再生的ECs丧失再生能力或修复的范围有限,虽其远端细胞具有复制能力,但邻近局部内皮增生、迁移形成的再生内皮还会存在表型改变、功能不足或紊乱而不能发挥正常内皮功能,也难到达损伤位置而不能完成损伤血管内膜的修复。细胞移植治疗近年来已成为治疗多种疾病的新策略,其目的是替代、修复或加强受损组织或器官的生物学功能。循环、骨髓及脾脏来源的内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)被认为在血管损伤后的内皮修复中起到了越来越重要的作用。并且,研究发现EPCs易于在体外被基因修饰后再进行移植,这使得EPCs成为血管损伤后一种理想的治疗手段。但是,尽管目前研究证实机体自身动员的EPCs能够参与内皮功能不全及血管损伤的修复,但并不能完全修复损伤血管并阻止过度新生内膜形成及血管不良重构的发生。其认为一方面是机体自身动员不足、自身来源的EPCs具有不同程度的功能不全;另一方面是循环中EPCs不能充分的优势分布并粘附至血管靶部位。因此深入了解EPCs的功能调节机制,找到促进移植的EPCs向损伤血管优势分布的措施将会很大程度的提高修复血管损伤的疗效。EPCs的功能能够被许多生长因子调节,其中包括血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、雌激素(estrogen, ESG)等。新近,HGF对EPCs的调节作用逐渐引起重视。HGF被发现能够促进人类CD34+造血干细胞的增殖与生存,在肺部受到损伤后能够从骨髓动员EPCs至受损伤的局部。在高血压、急性心肌梗塞、糖尿病并发严重并发症、外周血管阻塞性疾病和动脉粥样硬化的病人血清中,HGF的浓度是升高的。并且,有许多证据表明,在血管损伤局部有HGF的表达,对促进局部内皮修复有重要的作用。HGF促进细胞增殖主要是通过与其特异性的由原癌基因编码的受体c-Met相结合后开始的。HGF与其受体结合后,磷脂酶C-γ(phosphatidase c-γ, PLC-γ)被磷酸化,磷酸化的PLC-γ引起了三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)介导的内质网(endocytoplasmic reticulum, ER)钙库耗竭和接下来的细胞外钙离子通过细胞膜的内流。ER钙库耗竭引起的细胞膜钙离子内流通道被称为钙库操作性钙通道(store-operated Ca2+ channels, SOCCs)。在许多非兴奋性细胞,SOCCs被认为是广泛存在的调节钙离子内流的机制。Ca2+在细胞内充当第二信使的作用,参与细胞增殖、生存、分化、运动等多种功能。SOCCs的激活依赖于钙池的耗竭,因此ER必须把钙库耗竭的信息传递给细胞膜上的钙通道。一种名为间质交感分子1(stromal interaction molecule 1, STIM1)的跨膜蛋白被认为是激活SOCCs的重要分子。STIM1被认为是ER上钙库容量的感受器,细胞在静息状态时分布于ER膜表面,钙离子的耗竭导致了STIM1构象迅速发生改变并聚集到细胞膜附近。这种重新分布被认为起到了信号传递作用,将ER上钙离子耗竭的信号传递给了细胞膜上的钙离子通道,导致钙离子通道的开放。在HGF对EPCs的增殖调控中,STIM1及SOCCs是否参与其中,调控机制如何,目前国内外均无深入研究。另外,国外及我们的研究证实静脉输注的EPCs能够优势分布至血管损伤部位参与损伤血管修复,但移植的EPCs定向优势分布的机制仍不清楚。一般认为,损伤局部的微环境和移植干细胞之间的相互作用促使移植的干细胞向损伤血管定向优势分布。损伤局部上调表达的炎性因子可能起到一定作用。除炎性因子外,其他一些相对特异的因子如基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1, SDF-1)也发挥一定作用。近来研究发现,HGF也能介导细胞优势分布,在血管损伤局部存在HGF表达。因此,我们有理由推测HGF/c-Met能够通过趋化作用介导EPCs的优势分布,且局部的HGF能够促进移植的EPCs存活,提高细胞移植的效果。本课题通过1、用RNA干扰STIM1的方法,研究了STIM1在HGF诱导的EPCs增殖效应中的作用。2、构建c-Met的腺病毒表达载体,转染至EPCs,使之高表达c-Met,通过静脉将之输注大鼠体内。利用血管损伤部位含有HGF的特点,以期达到其促进EPCs在移植体内存活并通过HGF/c-Met介导其向血管损伤部位优势分布的目的。从而为丰富干细胞研究的理论、进一步认识血管损伤修复机制及探索修复血管损伤的有效方法提供帮助。2.方法:2.1 EPCs的分离、培养、鉴定密度梯度离心法获取大鼠骨髓及脾脏单个核细胞,在添加VEGF的DMEM培养液中常规培养,显微镜下观察细胞生长、形态学变化;UEA-I结合和DiI-LDL摄取实验观察EPCs是否具有内皮细胞功能特性;CD34、CD133、VEGFR-2流式鉴定是否具有内皮祖细胞表型。2.2观察HGF对EPCs增殖功能的影响胰酶消化EPCs后,接种至96孔板(1×105 cells/mL), EPCs经无血清培养同步化后,用四唑盐比色法(MTT)测定EPCs增殖变化。2.3 RNA提取与半定量及实时定量PCR用TRIzol试剂盒提取总RNA,根据M-MLV反转录试剂盒说明反转录CDNA,随后进行PCR检测,ABI PRISM 7000软件及荧光染料PCR法行定量PCR检测。2.4 Westernblot检测STIM1蛋白表达。2.5激光共聚焦检测内皮祖细胞细胞内钙离子荧光强度变化。2.6 STIM1的RNA干扰载体由本实验室郭瑞威博士提供。2.7重组腺病毒Ad-c-Met的构建从美国ATCC购得目的基因c-Met片段,由北京宝赛生物公司通过同源重组系统构建c-Met的病毒过表达载体。2.8观察c-Met在血管损伤修复过程中的作用用1-2月龄的SD大鼠复制颈动脉球囊损伤模型,然后从尾静脉注入转染了c-Met的EPCs。观察过表达c-Met对损伤后第10天血管再内皮化以及第21天新生内膜增厚的影响。3.结果:3.1 EPCs分离、培养、鉴定:相差显微镜下可见分离后单个核细胞呈圆形悬浮于培养基中,胞体透亮,折光性好;细胞培养5d,可以观察到细胞增多增大并伸展呈椭圆形、短梭型细胞,有少量细胞突起,集落形成较多表明细胞增殖旺盛,有时可见到内皮祖细胞首尾相连,呈线状排列;培养7-10d,长梭型细胞较前明显增多,并呈簇状生长,有一定方向性,形成细胞团,簇状细胞中央细胞呈圆形,外周呈放射状;培养14d,有些培养瓶中可看到细胞首尾相连,具有成网状血管样趋势生长;继续培养至21d,细胞相互融合呈铺路石状,用acLDL-Dil和FITC-UEA-l对细胞染色后,通过荧光倒置显微镜鉴定,FITC-UEA-l结合阳性细胞呈现绿色荧光, acLDL-Dil摄取阳性细胞呈现红色荧光, UEA-l和DiLDL双染色阳性细胞呈现黄色荧光,这些双染的细胞被认为是正在分化的EPCs。利用细胞流式分析技术(FACS)分别检测CD133、CD34、VEFGR-2在分离培养7d左右细胞表面的表达,我们观察到CD133、CD34及VEGFR-2在培养细胞中的阳性率分别为85.28%、70.49%和96.68%。3.2 HGF对EPCs增殖能力的影响不同浓度梯度的HGF(2-20 ng/ml)刺激EPCs 48小时后发现,EPCs的增殖能力随着HGF刺激浓度的增加而增加。因此,我们的结果显示HGF能够促进EPCs的增殖。在本实验中其最大效应发生在10 ng/ml左右。3.3 HGF刺激EPCs引起了经SOCCs的钙离子内流增加使用HGF对EPCs刺激48小时再测定经钙库操纵性钙通道的钙内流(store-operated Ca2+ entry, SOCE),用共聚焦显微镜检测了单个细胞内ER清空前后钙离子浓度的变化。在细胞外钙缺乏的情况下,当加入2μM内质网钙离子泵拮抗剂毒胡萝卜素后(thapsigargin, TG),ER钙离子库被清空。当细胞外钙恢复以后(CaCl2; 5 mM)可以看到一个很快的钙离子内流,这是由于钙库清空后引起的SOCE而引起的,与对照组相比,SOCE的最大幅度约为原来的1.5倍。3.4 SOCE对HGF诱导的EPC增殖能力的影响。观察了SOCCs阻断剂对EPCs增殖效应的影响。在给予2-APB;100μM and BTP-2;10μM提前处理的EPCs组,同HGF刺激组比较,明显地抑制了EPCs的增殖效应。这些结果表明,SOCE参与了EPCs的增殖活动,而且在其中起到了重要的作用。3.5 HGF作用于EPCs引起了STIM1表达的上调。使用了荧光定量PCR及Westernblot检测了STIM1在HGF刺激的表达情况。STIM1 mRNA水平在刺激前的EPCs中处于非常低的水平,在HGF刺激12小时后增加了约2.5倍。24小时后增加幅度最大,约3.8倍。免疫印迹法分析也证实了相同的结果。这些结果证实了STIM1的表达在HGF刺激后发生了上调。3.6 RNA干扰后STIM1表达后抑制了SOCE及HGF诱导的EPCs的增殖效应用STIM1的腺病毒干扰载体,干扰STIM1的蛋白表达。转染48小时后,与对照组相比较STIM1蛋白表达减低了约70%。与对照组相比较,HGF刺激组STIM1的蛋白表达升高了约3倍。在siRNA+HGF组,STIM1蛋白表达与HGF组比较降低了约80%。而且,我们还研究了RNA干扰STIM1后对EPCs上SOCE的影响。与非干扰组比较,干扰组的SOCE上升最大幅度明显下降。MTT法测定了细胞的增殖能力,与对照组相比较,干扰组的增殖能力明显下降。这些结果表明STIM1在EPCs的增殖效应中起到了重要的作用。3.7过表达c-Met对球囊损伤后血管再内皮化的影响EPCs转染c-Met后,移植入球囊损伤颈动脉后的大鼠,伊文氏蓝染色来观察过表达c-Met对损伤血管第10天再内皮化的作用,选用再内皮化面积/动脉总面积这一比值作为评价指标。损伤10天时对照组(未移植组)、Ad-GFP-EPCs、Ad-c-Met-EPCs组再内皮化率分别是25.92±4.15%、43.21±7.24%、64.25±8.90%,说明c-Met过表达明显促进早期时损伤血管的再内皮化,提示c-Met转染EPCs后对损伤血管的再内皮化有促进作用3.8过表达c-Met对球囊损伤后血管内膜增生的影响在血管损伤后第21天,对照组(未移植组)、Ad-GFP-EPCs、Ad-c-Met-EPCs转染组大鼠损伤颈动脉内、中膜比值为1.28±0.23、0.63±0.13、0.29±0.06,c-Met转染组明显低于GFP及对照组大鼠损伤颈动脉内、中膜的比值,提示过表达c-Met抑制了球囊损伤后第21天大鼠颈动脉新生内膜的增厚。4.结论:1)、HGF促进EPCs的增殖;2)、HGF刺激EPCs引起了经SOCCs的钙离子内流增加;3)、SOCCs阻断剂明显地抑制了HGF诱导的EPCs的增殖效应;4)、HGF作用于EPCs引起了STIM1表达的上调;5)、RNA干扰STIM1表达后抑制了SOCE及HGF诱导的EPCs的增殖效应;6)、过表达c-Met显著促进大鼠球囊损伤早期血管再内皮化;7)、过表达c-Met抑制了大鼠球囊损伤后血管新生内膜的增厚。