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从生物体内提取,纯化酶是工业生产酶的一种重要手段。以廉价而丰富的鱼内脏作为工业生产酶的原料来源对降低工业成本、增加酶产出具有较强的可行性。我国是罗非鱼养殖大国,产量居世界首位,2005产量达104万多吨。我国的南方地区由于气候适宜,罗非鱼的养殖迅速发展,特别是广东省罗非鱼总产量约占全国的40%以上。罗非鱼已成为我国南方地区重要的淡水养殖与加工品种之一。集约式的鱼类加工方式为罗非鱼内脏的收集与利用提供了有利的条件。由于缺乏基础性的研究,目前对淡水鱼内脏的加工方式主要为传统的加工。加工产品的科技含量不高、附加值也比较低,因此在国际竞争中难以占有一席之位。罗非鱼加工后所剩下的内脏多年来也一直未充分地发挥其应有的经济价值。
酶工程为现代高、新研究领域的研究热点之一。以罗非鱼加工后所剩下的内脏为原料进行酶资源的开发、利用有着积极的意义。本文的主要工作及结论如下:
1.罗非鱼为生长在热带与亚热带之间的一类特殊鱼种,因此鱼内脏中的酶种类较为复杂。如何更加合理的对罗非鱼内脏加以利用,酶的筛选工作非常的重要。
实验采用列举法对罗非鱼内脏中可能存在且经济价值较高的8种酶进行了逐一的活性筛选。得出如下结论:蛋白酶,超氧化物歧化酶,胆碱酯酶的酶活量要高于从同等重量的其它原料中提取出的酶活量,碱性磷酸酶在罗非鱼肝脏中的酶活含量也比较高,因此以上四种酶都具有提取研究价值。
2.本实验通过采用匀浆破坏细胞膜法和蛋白酶酶活自动激活法提取罗非鱼胃、肠道中的蛋白酶。匀浆破坏细胞膜使酶分子释放出来,蛋白酶原被自动激活的同时蛋白酶抑制物被消化。通过L<,16>(4<5>)正交实验,提取罗非鱼胃、肠道蛋白酶的最佳条件为: 20℃于pH为7.0的磷酸缓冲液中提取2h。所得酶液经硫酸铵盐析,冷冻干燥得到了粗蛋白酶酶粉,其比活为208Umg<-1>。该蛋白酶的最适pH值为pH8.0~8.5,属于碱性蛋白酶,最适温度为35℃~40℃。蛋白酶主要存在于罗非鱼的胃和前肠部分。胃、前肠、中肠和后肠中的蛋白酶的最适pH依次为为pH5.50、pH7.0、pH8.0、pH9.0;它们的最适温度均为35℃左右。
3.采用Hitrap Q FF阴离子交换柱纯化法和SephadexG-100凝胶柱分离纯化法得到纯化蛋白酶,其比活为314U/mg,比未纯化的蛋白酶粉的酶比活提高了1.45倍。经SDS-PAGE电泳为单一蛋白酶带,其分子量为28KD。该酶最适pH为8.0~8.5,是一种弱碱性的蛋白酶,该酶在中性及弱碱性pH7.0~9.0的环境下具有比较好的稳定性;最适温度为37℃~42℃;在高温(>50℃)时,该酶失活很快,室温(25℃)稳定性比较好。
研究表明除Na<+>、K<+>对该酶无明显抑制作用外,Mn<2+>、ca<2+>、Mg<2+>、Cu<2+>、CO<2+>、Fe<3+>离子对酶活均有不同程度的抑制作用,Ag<+>、Pb<2+>对它几乎有完全抑制的作用。丝氨酸蛋白酶抑制
剂PMSF能抑制93.5%的蛋白酶活性,EDTA抑制作用不明显,按照Michael等人对蛋白酶的分类观点,该酶为一种丝氨酸蛋白酶,而非金属蛋白酶:DTT能激活该酶;胃蛋白酶抑制剂和脲素都可以使酶活性降低。
4.以壳聚糖-戊二醛交联法探讨了用壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂对蛋白酶进行固定化的研究。研究确定的最佳同定化条件为:1%的壳聚糖胶液中加入5%戊二醛使戊二醛终浓度为1%,于30℃交联6h后,4℃冰箱放置过夜,离心回收沉淀得到活化壳聚糖载体。接着按蛋白酶与壳聚糖的用量比为30mg/g(w/w)的比例加入,0.2mg/mL pH8.0的蛋白酶溶液,在室温下搅拌交联8h后于4℃冰箱放置过夜,蒸馏水冲去未被吸附的蛋白酶,冻干得到同定化蛋白酶,此时蛋白酶活性同收率可达71.2%。研究发现固定化蛋白酶的酶学特性比未固定前有很人的改善,固定化蛋白酶最适温度为40℃,它比游离蛋向酶高出了5℃且固定化后蛋白酶在35℃~50℃都有比较好的活性;固定酶比未固定前有较强的耐热性及保存稳定性且最适pH范围也要比游离下的要宽;游离蛋白酶的Km值(酪蛋白)为O.15%(w/v),固定化蛋白酶的Km值(酪蛋白)为0.059%,即游离蛋白酶的Km值是固定化酶的2.5倍,说明同定化酶对底物酪蛋白的亲和力大幅度增加了。
5.本文采用二次加热提取法,丙酮沉淀同收酶法和Hitrap<’TM> Q FF阴离子柱纯化法联川从罗非鱼肝脏提取、纯化出Cu、Zn-SOD样品。其比活为4895U/mg,SDS-PAGE电泳为单一蛋白酶带,其分子量为36KD。波长220nm~350nm紫外光扫描下发现样品Cu、Zn—SOD的最大吸收波长为265nm。该酶在pH6.0~9.0的环境下具有比较好的稳定性,pH>9.0或pH<6.0时它都很快的失活;75 ℃时加热它能短时的耐高温。
脲的加入使酶活性显著降低;β-巯基乙醇的存在导致酶失活;EDTA其浓度<3 mmol/L时,它可以属使Cu、Zn-SOD活性明显增强,EDTA>3 mmol/L时它与Cu、Zn—SOD中的金属离子结合,而使酶失活;DTT的修饰使SOD活性显著增加。
6.本文以壳聚糖.戊二醛交联法探讨了用壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂对SOD酶进行同定化研究。实验确定最佳同定化条件为:1%的壳聚糖胶液加入3%戊二醛使戊二醛终浓度为O.6%,于30 ℃交联6h后,4℃冰箱放置过夜,离心回收沉淀得到活化壳聚糖载体。接着按SOD酶/壳聚糖为40mg/g(w/w)的比例加入0.4mg/mL pH8.0的SOD酶溶液,在室温下搅拌交联8h后于4℃冰箱放置过夜,蒸馏水冲去未被吸附的酶液冻干得到同定化SOD酶。SOD酶活性回收率可达67.5%。研究发现固定化前后SOD酶对pH稳定,热稳定性和对酶抑制剂的稳定性及4℃中的贮藏稳定性都比未固定前有很大的改善。