【摘 要】
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乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一,也是全球女性因癌症死亡的主要原因。随着筛查的普及、诊断技术和治疗策略的进步,乳腺癌患者的预后和生活质量有了较大改善,但肿瘤的转移、复发以及一些特殊类型的乳腺癌如三阴性乳腺癌的治疗等问题依然存在。近年,随着抗肿瘤免疫治疗中T细胞免疫疗法的认可,掀起了肿瘤免疫研究的热潮,但在治疗中后期,肿瘤细胞会下调表面MHC分子,发生T细胞免疫逃逸。而天然免疫系统中的NK细胞则可不受M
【基金项目】
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中国国家自然科学基金面上项目（81372343）； 中国国家自然科学基金面上项目（81772809）；
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乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一,也是全球女性因癌症死亡的主要原因。随着筛查的普及、诊断技术和治疗策略的进步,乳腺癌患者的预后和生活质量有了较大改善,但肿瘤的转移、复发以及一些特殊类型的乳腺癌如三阴性乳腺癌的治疗等问题依然存在。近年,随着抗肿瘤免疫治疗中T细胞免疫疗法的认可,掀起了肿瘤免疫研究的热潮,但在治疗中后期,肿瘤细胞会下调表面MHC分子,发生T细胞免疫逃逸。而天然免疫系统中的NK细胞则可不受MHC分子限制发挥杀瘤作用,因此成为继T细胞之后抗肿瘤免疫治疗的新星。本课题以NK细胞亚群及其表面受体的表达情况为切入点,以NK细胞与乳腺癌细胞的相互作用为主线,借助免疫学、细胞生物学、组织病理学等手段,探讨浸润性乳腺癌中NK细胞亚群及其表面受体的表达情况,并且构建NK细胞体外活化体系达到改善NK细胞功能状态的目的。论文第一部分采用免疫组织化学染色技术、流式细胞术检测乳腺肿瘤局部及外周血中NK细胞亚群的分布、表面受体的表达情况。研究结果发现:（1）浸润性乳腺癌较纤维腺瘤患者局部组织中CD57+NK细胞浸润增多（P=0.020）,且CD57+NK细胞、CD57+CD16-NK细胞亚群浸润程度与肿瘤恶性度成反比（P=0.049,P=0.020）;（2）浸润性乳腺癌患者较乳腺纤维腺瘤患者比较,虽然外周血中CD56+CD16-NK细胞亚群比例增高（P=0.0085）,但其表面活化性受体NKp30表达下调（P=0.0101）,抑制性受体PD-1上调（P＜0.0001）;（3）浸润性乳腺癌患者外周血中CD56+CD16+NK细胞亚群表面活化性受体NKp30、NKG2D的表达较乳腺纤维腺瘤患者显著降低（P＜0.0001,P=0.0013）,抑制性受体PD-1显著增高（P＜0.0001）。论文第二部分采用流式细胞术、NK细胞分选技术、CD56+NK细胞与乳腺癌细胞株MDA-MB231共育等实验方法建立体外NK细胞与乳腺癌细胞相互作用的模型以及较优的NK细胞体外活化体系。研究结果发现:（1）MDA-MB231乳腺癌细胞株与NK细胞共育后,无论是CD56+CD16+NK细胞亚群,还是CD56+CD16-NK细胞亚群表面NKp30、DNAM-1活化性受体,均出现显著下调（P=0.0001,P=0.0004,P＜0.0001,P=0.0006）,抑制性受体 TIGIT、PD-1出现显著上调（P=0.0003,P＜0.0001,P＜0.0001,P=0.0016）,较好的还原了第一部实验中浸润性乳腺癌患者外周血NK细胞表面受体的状态。（2）我们构建的IL-15（20 ng/ml）、IL-12（20 ng/ml）、IL-2（100 ng/ml）高浓度组NK细胞活化体系可显著诱导NK细胞向CD56+CD16-NK细胞亚群分化（P=0.0041）,并上调CD56+CD16+NK细胞亚群表面NKp30、NKG2D活化性受体（P=0.0015,P=0.0001）,下调CD56+CD16+NK细胞亚群、CD56+CD16-NK细胞亚群表面PD-1抑制性受体（P＜0.0001,P＜0.0001）,且这种作用与IL-12、IL-15的浓度存在一定相关性;（3）在NK细胞与乳腺癌细胞株MDA-MB231共育时,高浓度组NK细胞活化体系中CD56+CD16+NK细胞亚群以及CD56+CD16-NK细胞亚群表面NKp30、NKG2D活化性受体表达水平均被逆转,出现上调现象（P=0.0017,P＜0.0001,P=0.0029,P=0.0137）,对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB231的杀伤能力也出现增强（P=0.0018）,并促进CD56+CD16-NK细胞亚群胞内穿孔素分泌显著升高（P=0.0002）。综上,浸润性乳腺癌患者与乳腺纤维腺瘤患者比较,肿瘤局部CD57+NK细胞、CD57+CD16-NK细胞亚群的浸润数量随病程进展减少,外周血中CD56+CD16-NK细胞亚群比例虽然出现增多,但NK细胞表面呈现活化性受体下调、抑制性受体上调的状态。我们建立的高浓度组体外NK细胞活化体系成功的逆转了 NK细胞与三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB231相互作用时的状态使其表面活化性受体出现上调,并促进CD56+CD16-NK细胞亚群胞内穿孔素的分泌,使NK细胞对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB231的杀伤能力增强,为乳腺癌领域NK细胞免疫疗法提供了新思路。
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