【摘 要】
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目的:本文旨在探讨Atg7缺失对小鼠CD11b+Ly6G-髓系细胞的影响方法:（1）流式检测自噬必需基因对髓系细胞及其亚群的影响:采用造血系统特异性缺失自噬的 atg7floxp/floxp;vav-iCre 和 atg5floxp/floxp;vav-iCre 两种小鼠模型,用 PCR 和western blotting技术检测小鼠模型构建是否成功。获得野生型和atg7floxp/floxp;v
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目的:本文旨在探讨Atg7缺失对小鼠CD11b+Ly6G-髓系细胞的影响方法:（1）流式检测自噬必需基因对髓系细胞及其亚群的影响:采用造血系统特异性缺失自噬的 atg7floxp/floxp;vav-iCre 和 atg5floxp/floxp;vav-iCre 两种小鼠模型,用 PCR 和western blotting技术检测小鼠模型构建是否成功。获得野生型和atg7floxp/floxp;vav-iCre以及atg5floxp/floxp;vav-iCre小鼠全骨髓细胞,采用流式细胞术检测两种小鼠模型的CD1 1b髓系细胞和其亚群CD1 1b+Ly6G-和CD1 1b+Ly6G+细胞的数量和比例情况。（2）转录组学分析敲除atg7基因的CD11b+Ly6G-细胞变化:利用流式分选获得atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠CD11b+Ly6G-细胞,进行转录组高通量测序,并进行差异表达分析、聚类分析、GO（Gene ontology）分析等。（3）检测atg7基因缺失后组蛋白H3.1的表达:取野生型和atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠全骨髓细胞,利用流式细胞术、western blotting和免疫荧光技术,检测atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠全骨髓细胞、单个核细胞和髓系细胞中组蛋白H3.1的表达和定位情况。（4）检测atg7基因缺失后CD11b+Ly6G-细胞的衰老表型:利用流式抗体标记atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠CD1 1b+Ly6G-细胞,采用流式细胞术检测其衰老相关指标,包括:活性氧水平、线粒体数量以及细胞凋亡水平（Annexin V＆PI）。结果:（1）Atg7对髓系细胞数量和比例的影响不依赖自噬:atg7基因缺失导致CD11b+Ly6G+细胞和CD11b+Ly6G-细胞的数量减少,而atg5缺失后两个亚群细胞的数量无显著差异。并且atg7缺失导致髓系细胞中CD11b+Ly6G-细胞占比增加,CD11b+Ly6G+细胞占比减少。敲除atg5却呈现相反表型。（2）Atg7基因缺失导致CD11b+Ly6G-细胞核小体/染色质组装异常:atg7基因缺失造成CD11b+Ly6G-细胞中321个基因发生下调,237个基因发生上调。在上调的基因中,有大约五分之一与核小体/染色质组装相关。核小体核心骨架成分组蛋白成员的转录水平也出现上调。（3）Atg7基因缺失导致组蛋白H3.1在胞质中发生异常积累:atg7基因缺失后CD11b+Ly6G-细胞中组蛋白H3.1蛋白水平异常升高,且在胞质中发生不正确定位。（4）Atg7基因缺失导致CD11b+Ly6G-细胞呈现衰老表型:atg7基因缺失后CD11b+Ly6G-细胞的衰老指标呈上升趋势,包括活性氧水平升高、线粒体数量积累和细胞凋亡增加。结论:（1）Atg7在骨髓CD11b+髓系细胞中存在独立于自噬以外的作用;（2）Atg7基因缺失导致CD11b+Ly6G-细胞核小体组装相关基因表达混乱;（3）Atg7基因缺失导致组蛋白H3.1蛋白在CD11b+Ly6G-细胞的胞质中发生异常积累和错误定位;（4）Atg7基因缺失导致CD11b+Ly6G-细胞呈现衰老表型。
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