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间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种成体多能干细胞，可以分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞和神经细胞。间充质干细胞最先是从骨髓中分离得到的，后来研究发现间充质干细胞还可以从脂肪组织、胎盘组织、脐带组织、脐带血、肌肉组织、真皮组织和骨膜等多种成体和胚胎组织中分离得到。近年来，从脐带组织中分离的间充质干细胞得到了越来越多的关注。脐带间充质干细胞(Umbilical cord derived MSCs，UC-MSCs)易于获取且无伦理问题，它们免疫原性低且具有自我更新能力，与骨髓来源的间充质干细胞相比细胞增殖速度快。 本论文中所用的间充质干细胞是从新生儿脐带中分离得到的。参照国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy，ISCT)和一些文献报道的间充质干细胞的认证标准，用流式细胞仪检测了分离的细胞表面特异性抗原的表达情况。检测结果显示从脐带中分离的细胞表达间充质干细胞的特异性标记蛋白CD90、CD44、CD147、CD13、CD29、CD105，不表达造血干细胞和淋巴细胞标记物CD34、CD45、CD38、HLA-DR。流式细胞仪鉴定以后我们通过成骨诱导实验检测了细胞的分化潜能。实验结果显示成骨诱导后细胞中碱性磷酸酶的活性增强，骨细胞特异性的蛋白collagenⅠ的表达增多，Vonkossa染色实验显示细胞外发生钙沉积，实验结果表明分离的细胞发生成骨分化。流式鉴定和成骨分化实验结果证实从新生儿脐带中分离的贴壁细胞具有间充质干细胞的特性。 在脐带间充质干细胞成软骨诱导实验中，我们将脐带间充质干细胞包被于Ⅰ型鼠尾胶原蛋白形成的3-D环境中进行成软骨诱导实验。成软骨诱导三周后，HE染色显示诱导组细胞呈现软骨细胞样形态，而非诱导组细胞仍然呈纤维状生长；同时细胞凋亡实验显示包埋在胶原蛋白中的细胞仍然保持较好的细胞活性；alcain blue和toludine blue染色显示成软骨诱导后细胞外基质蛋白的表达增高。实时定量PCR和免疫组化检测结果表明软骨细胞特异性蛋白collagenⅡ、cartilageoligomeric matrix protein(COMP)、aggrecan(AGN)在软骨诱导后的表达明显增加。实验结果证实脐带间充质干细胞在Ⅰ型鼠尾胶原蛋白形成的3-D环境中成功分化成软骨细胞。 MicroRNA(miRNA)是一种约17-25 nt的非编码的小分子RNA。它可以与靶基因的3’UTR结合在转录后水平上调控基因的表达。研究表明，miRNA可通过调控一些特殊的转录因子和发育相关基因的表达来调控间充质干细胞的增殖、自我更新和分化。 利用生物芯片技术我们比较了脐带间充质干细胞成软骨诱导前后miRNA的表达差异。芯片检测的760个miRNA中，成软骨诱导前后表达差异显著的有28个，其中包含13个在成软骨诱导后表达增高的miRNA和15个在成软骨诱导后表达降低的miRNA。MiRNA芯片分析结果用Real-time PCR实验确认，两者实验结果相符合。通过Targetsacn(http：//www.targetscan.org)、Pictar(http：//pictar.mdc-berlin.de)和miRanda(http：//microma.sanger.ac.uk/targets)等在线软件分析后，我们选定了hsa-miR-889和hsa-miR-485-3p两个在成软骨诱导后表达明显下降的miRNA，并探讨了它们在脐带间充质干细胞成软骨分化过程中的调控作用。软件分析显示这两个miRNA的靶蛋白都是成软骨过程中重要的早期转录因子SOX9蛋白。 荧光素酶双荧光报告实验检测发现hsa-miR-485-3p和hsa-miR-889对SOX9基因的表达有抑制作用。为了揭示miRNA对间充质干细胞成软骨分化的调控作用，我们利用慢病毒感染和流式分选技术获得了稳定表达miRNA的脐带间充质干细胞；并将稳定表达miRNA的脐带间充质干细胞进行成软骨诱导，转染空载体和未转染组细胞作为对照。成软骨诱导后检测发现SOX9在稳定表达miRNA组细胞的表达量比对照组细胞的表达量低。组织化学染色和实时定量PCR检测发现软骨特异性蛋白在稳定表达miRNA组细胞的表达量比对照组细胞的表达量低，实验结果表明hsa-miR-485-3p和hsa-miR-889通过抑制SOX9基因的表达降低了脐带间充质干细胞成软骨分化的能力。实验中我们探讨了hsa-miR-485-3p和hsa-miR-889在软骨分化过程中表达下降的调控机制，实验结果显示软骨分化过程中重要的信号通路TGF-β信号通路可以抑制hsa-miR-485-3p和hsa-miR-889的表达。 在本实验中，我们还发现hsa-miR-485-3p和hsa-miR-889可以增强脐带间充质干细胞的成神经分化能力。实验结果显示成神经诱导后，稳定表达miRNA组细胞中神经特异性蛋白nesfin的表达量比对照组细胞中nestin的表达量高。同时实验表明hsa-miR-485-3p和hsa-miR-889的过表达可以降低细胞周期蛋白抑制因子p21的表达，缩短细胞周期，使细胞增殖速度加快。 综上所述，本论文从脐带组织中分离到了间充质干细胞，并且对脐带间充质干细胞在Ⅰ型胶原蛋白所形成的3-D环境中向软骨分化的能力及miRNA在软骨分化中的调控机制进行了深入研究。实验结果显示脐带间充质干细胞在Ⅰ型胶原蛋白凝胶中可以成功分化为软骨细胞；分化调控机理研究显示hsa-miR-485-3p和hsa-miR-889可以通过抑制SOX9蛋白的表达降低脐带间充质干细胞的成软骨分化能力。