论文部分内容阅读
研究背景及目的：1998年Martinez-Martinez等最早发现在肺炎克雷伯菌UAB1上存在质粒介导的喹诺酮类耐药机制（Plasmid-Mediated Quinolone Resistance，PMQR）。Qnr通过与DNA回旋酶及拓扑异构酶Ⅳ结合而抑制环丙沙星的作用从而导致大肠埃希菌J53接合子的耐药性升高。不少研究显示qnr在全球范围内存在。迄今已发现qnr多个亚型，如qnrA、qnrB、qnrS、qnrC。2006年美国学者发现的qnrB是一种全新的基因型，与qnrA1的核苷酸同源性仅为49．5％（氨基酸同源性39．5％），其分布有待研究，来源尚不清楚。目前仅印度、美国、台湾和韩国有关于检出qnrB的报道，qnrB常与产SHV-12、CTX-M-15、IMP-8与DHA等β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌密切相关。我们对2005年10月至2006年4月间我院分离的120株头孢菌素耐药的肠杆菌科细菌进行PCR检测、接合验证等以研究qnrA、qnrB的分布，同时对qnr阳性菌株产SHV或CTX-M型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）及AmpC酶的情况进行初步分析，从而为PMQR的进一步研究提供实验依据。方法：1．细菌的鉴定和药敏采用Microscan Walkaway 40?全自动细菌鉴定及药敏分析系统。2．采用碱裂解变性法(E．Z．N．ATM plasmid mini Kit)提取细菌质粒DNA，PCR法检测qnr的存在，qnrA和qnrB的引物分别为A-F（5’-ATTTCTCACGCCAGGATTTG）、A-R（5’-GAGATTGGCATTGCTCCAGT）及MFQ1、MFQ2，产物大小分别为413bp、469bp，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳、成像。每次均设阳性对照和阴性对照，参考菌株Kpneumoniae UAB1（gnrA）及E．coli J53．plus pMG298（gnrB）由上海华山医院抗生素研究所王明贵教授和美国Lahey Clinic的G．A．Jacoby教授馈赠。3．接合实验验证qnr的转移性，受体菌为E．coli J53（Azide resistant），对接合子的选择采用含100μg╱mL氨苄西林、100μg／mL叠氮钠、8μg╱mL头孢噻肟的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA），将接合子分别接种至含与不含0．06μg／mL环丙沙星的TSA平板上观察喹诺酮类药物耐药性的转移。4．比较受体菌、供体菌及接合子的MIC值，包括多种喹诺酮类药物，采用琼脂对倍稀释法。5．PCR法分别检测qnrA、qnrB阳性菌株orf513或orf1005的存在。采用引物qnrB／B’-CDS扩增qnrB的全序列，由Invitrogen公司采用ABIPRISMTM 3730XL DNA Analyzer测序，结果于www．ncbi．nlm．nih．gov上进行GenBank+EMBL+DDBJ比对。6．对来自同一患者的不同菌种进行检测以了解qnr在体内是否存在水平传播。一株鲍曼不动杆菌同时包含qnrA、qnrB，纯化PCR产物后连接到pMD-18T载体上，转化至E．coli DH5α感受态细胞内，采用抗生素平板筛选单克隆菌落。对经PCR鉴定的阳性克隆，提纯质粒DNA完成测序。7．采用Nitrocefin法检测供体菌产β-内酰胺酶情况，改良三维实验了解细菌产酶表型，Multiplex-PCR法检测blaSHV、blaCTX-M及多种质粒型AmpC酶的b／a基因（包括DHA、MOX、CIT、ACC、FOX等）。结果：1．qnr的检出：120株肠杆菌科细菌中，分别有37株含qnrA，33株含qnrB，其中13株同时检出qnrA、qnrB；其中肠杆菌属、克雷伯菌属细菌及大肠埃希菌qnr的检出率分别为52．9％、57．1％和50．0％。2．接合实验：除一株肺炎克雷伯菌外其余56株接合子均能在TSA选择平板上生长；而一株接合子在含环丙沙星的TSA上不能生长。3．MIC测定：各种抗菌药物对接合子的MIC值较受体菌均有不同程度提高。仅加替沙星、头孢吡肟对qnr阳性菌株的抗菌活性相对较好。4．orf513及orf1005检测：qnrA、qnrB阳性菌株中各有7株检测到Drf513或orf1005的存在。5．qnrB全序列扩增：18株细菌可扩增出681bp或645bp的全序列片段。部分菌株的qnrB序列与qnrB1（DQ351241）完全一致，但4株细菌的qnrB序列与qnrB3（DQ303920）相比，存在3个位点核苷酸序列突变（201 A→T，271位T→G，498位G→A）而导致相应编码蛋白的氨基酸存在两个位点差异：第67位、91位分别由赖氨酸、丝氨酸变成天冬酰胺及丙氨酸（K67N，S91A）。6．qnr在患者体内水平传播：5个患者在首次检出qnr后，相同患者后续分离到的其它菌种中（7株／5人），仅1株不含qnr基因。且对于同一患者，后续分离到的菌株与首次检出株含有同一类型的qnr，也可能同时包含qnrA、qnrB。鲍曼不动杆菌的qnrB部分序列与qnrB1完全一致，qnrA部分序列与qnrA1相比有一个核苷酸改变（167位C→T）。7．供体菌β-内酰胺酶检测：所有细菌均可使Nitrocefin纸片变红色；33株细菌产ESBLs或AmpC酶。49株（89．1％）供体菌包含blaSHV或blaCTX-M；约70．0％的qnr阳性菌可检测到AmpCβ-内酰胺酶相关的bla基因，以DHA型及MIR-1T、ACT-1型为主。结论：1．2005年10月-2006年4月我院临床存在qnr阳性菌株的流行，本研究在国内首次发现qnrB介导的喹诺酮类药物的耐药机制；2．发现一种与qnrB3最为接近的新的qnrB样基因亚型；3．首次在聚团多源菌、鲍曼不动杆菌中检出qnr的存在；4．包含qnr菌株多为产ESBLs或AmpC型β-内酰胺酶的临床分离肠杆菌科细菌，qnrB常与blaSHV或blaCTX-M、blaDHA关系密切。