【摘 要】
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目的:原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是常见的恶性肿瘤。分子靶向药物治疗可显著改善晚期HCC患者预后。近年来对HCC致病机制的研究发现,在HCC进展过程中,micro RNAs发挥着重要的调节作用,成为HCC诊断及治疗的重要靶点。其中,miR-103a-3p在人膀胱癌、胃癌、大肠癌等肿瘤中发挥促癌作用,但其在HCC中的作用及机制尚不明确。内质网跨膜蛋白EV
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目的:原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是常见的恶性肿瘤。分子靶向药物治疗可显著改善晚期HCC患者预后。近年来对HCC致病机制的研究发现,在HCC进展过程中,micro RNAs发挥着重要的调节作用,成为HCC诊断及治疗的重要靶点。其中,miR-103a-3p在人膀胱癌、胃癌、大肠癌等肿瘤中发挥促癌作用,但其在HCC中的作用及机制尚不明确。内质网跨膜蛋白EVA1A（Eva-1 Homolog A）是近年来研究者从人肾脏c DNA文库中新鉴定出的自噬与凋亡调控蛋白。最新研究发现,该蛋白在HCC中显著下调,在HCC细胞中过表达EVA1A能够通过上调TP53抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭。而且研究表明,在奥沙利铂敏感的HCC细胞中,EVA1A能够被miR-125b靶向下调,提示HCC中EVA1A的低表达可能由micro RNAs靶向调控。前期通过生物信息学预测,发现EVA1A可能是miR-103a-3p的靶分子。本研究将详细分析miR-103a-3p在HCC中的功能,鉴定出其下游靶分子并从下游靶分子角度解析miR-103a-3p调控肝细胞癌的机制,为进一步完善和阐明HCC的发病机制以及为HCC诊治提供理论依据。方法:首先通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测miR-103a-3p在HCC组织、配对癌旁组织和HCC细胞系（QGY-7703、Hccl-M3、PLC-PRF5）、人正常肝细胞系L02中的表达。细胞划痕法、Transwell法、CCK8法和平板克隆法分别检测miR-103a-3p对HCC细胞迁移、侵袭和增殖的影响。其次,生物信息学预测miR-103a-3p下游靶基因;双荧光素酶报告基因验证miR-103a-3p和EVA1A 3’UTR区的结合关系;Western blot和RT-qPCR法检测miR-103a-3p对EVA1A表达的影响;共表达miR-103a-3p和EVA1A后检测对miR-103a-3p在HCC中促癌作用的影响。最后,通过Western blot和流式细胞术检测miR-103a-3p对TP53表达和细胞凋亡的影响;JC-1染色、DCFH-DA染色、ATP检测试剂盒检测其对线粒体膜电位、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生和ATP生成的影响,分析miR-103a-3p对线粒体功能的影响。结果:RT-qPCR结果显示,HCC组织和细胞系中miR-103a-3p水平显著高于配对癌旁组织和正常肝细胞L02（P<0.001）。miR-103a-3p过表达显著下调EVA1A和TP53的表达水平（P<0.05）;促进了HCC细胞迁移（P<0.05）、侵袭（P<0.01）和增殖（P<0.05）。抑制miR-103a-3p表达显著上调EVA1A和TP53的表达水平（P<0.05）;抑制了HCC细胞迁移（P<0.05）、侵袭（P<0.01）和增殖（P<0.05）;造成HCC细胞凋亡和线粒体功能障碍。生物信息学预测发现,EVA1A是miR-103a-3p潜在的下游靶基因;双荧光素酶报告基因实验显示,共转染miR-103a-3p和EVA1A-3’UTR-wt荧光素酶活性显著降低（P<0.001）。与单独过表达miR-103a-3p相比,共表达Myc-EVA1A组细胞迁移（P<0.01）、侵袭（P<0.01）和增殖（P<0.01）活性明显减弱;与单独抑制miR-103a-3p表达相比,同时敲降EVA1A减弱了单独抑制miR-103a-3p表达造成的细胞凋亡和线粒体功能障碍。结论:我们的研究全面分析了miR-103a-3p在HCC中的作用,miR-103a-3p具有促HCC细胞迁移、侵袭和增殖的功能,通过靶向抑制EVA1A发挥促癌作用。抑制HCC细胞中miR-103a-3p的表达会引起线粒体功能障碍诱发细胞凋亡发挥抑癌作用。HCC中miR-103a-3p的表达上调可能是HCC发生的一个机制。miR-103a-3p可能是HCC诊断和治疗的潜在靶点。
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