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铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌,在临床上常常引起难治性和顽固性感染。随着广谱抗生素药物的广泛大量使用,该菌的多重耐药现象和发生频率呈现上升趋势。在铜绿假单胞菌基因组中,有一部分基因间隔区序列,虽然不能编码蛋白质产物,但能够与特定的蛋白质结合,或是具有启动子活性,通过近端或远端调控甚至参与到复杂的调控网络而调节某些基因的功能。研究与耐药性密切相关的基因间隔区调控功能,将作为另一个有效的突破口,对于解释铜绿假单胞菌复杂的多重耐药机制有重要意义。
本文以一株卡那霉素敏感的临床分离株PA68为出发菌株,应用人工Mu转座技术构建突变文库并从中筛选得到一株对庆大霉素抗性明显增强的菌株C18。突变株通过基因克隆、核苷酸序列分析,确定在基因组上的Mu插入位点为PA5471-PA5472之间的基因间隔区。该基因间隔区的上下游基因PA5471和PA5472均属Ⅳ类基因。
通过生物信息学分析,该基因间隔区内含有假定的启动子序列,因此构建野生型和Mu插入突变型基因间隔区的启动子-报告基因融合质粒,并在铜绿假单胞菌PA68中进行表达。报告基因产物β-半乳糖苷酶活性分析结果显示,野生型和突变型的基因间隔区均有转录活性,并且Mu插入突变后该间隔区的转录活性明显增强。
本文首次利用Mu体外突变产生系统对具有启动活性的基因间隔区进行功能研究,构建了一系列的该间隔区序列的15 bp随机插入库,并对启动子.报告基因融合质粒的β-半乳糖苷酶活性进行详细分析。实验结果表明:该间隔区内不同位置的序列具有不同的调控功能:PA5472基因下游20bp处是可能的启动子序列,PA5472基因下游100bp-140bp处是可能的阻遏物结合区域。最后通过DNA微阵列分析,对C18突变株和同一背景下的野生株PA68同时进行基因表达图谱分析,推测PA5471-PA5472基因间隔区可能参与的调控功能及产生庆大霉素抗性变化的生物学通路。