日本血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病，曾流行于我国南方12个省（市）、自治区，对社会经济和人类健康造成严重影响。半个多世纪以来，我国血吸虫病防治取得了举世瞩目的成就，至2010年底，全国血吸虫病病例数由建国初期的1100余万例降至32.6万例。但当前我国血吸虫病防治形势依然比较严峻，局部地区钉螺面积有所上升，出现了疫情反复。目前我国血吸虫病防治的主要难点在于其中间宿主钉螺难以彻底消灭；保虫宿主种类多；人、畜重复感染严重，单靠以化学药物治疗为主的防治策略不能有效控制血吸虫病流行。加强日本血吸虫病疫苗和新治疗药物研究，是当前我国血吸虫病防治的重大需求。加强血吸虫与不同适宜性宿主相互作用关系等研究，可为筛选血吸虫疫苗候选分子和新药物靶标提供重要基础。多达46种哺乳动物可自然感染日本血吸虫，但不同哺乳动物对日本血吸虫的适宜性有所不同。根据血吸虫感染宿主后在其体内生长发育等情况，可以将宿主分为适宜宿主与非适宜宿主。东方田鼠是迄今为止在日本血吸虫病疫区发现的唯一一种感染血吸虫后不致病的哺乳动物，具有天然抗日本血吸虫病特性。黄牛、水牛和山羊是血吸虫病疫区三种最重要天然保虫宿主，大鼠、小鼠及新西兰大白兔是最常使用的三种血吸虫病实验动物，其中黄牛、山羊、小鼠、新西兰大白兔是日本血吸虫的适宜宿主；水牛、大鼠属于非适宜宿主。本课题组前期对大鼠、小鼠和东方田鼠三种不同适宜性实验动物宿主进行了感染适宜性差异机制的相关研究，获得了一些有重要科学价值的实验数据或结果。本文着重对黄牛、水牛、山羊三种不同适宜性天然宿主的感染差异及其机制进行分析，获得以下研究结果：1.日本血吸虫在不同适宜性宿主中的发育和致病观察以日本血吸虫尾蚴人工感染黄牛、水牛、山羊、Wistar大鼠、BALB/c小鼠及新西兰大白兔，7w后收集虫体。结果表明六种动物的虫体回收率有显著差别，由高到低依次为：山羊、BALB/c小鼠、新西兰大白兔、黄牛、水牛、Wistar大鼠。虫体的长度和宽度亦存在显著差别，适宜宿主体内虫体明显长于非适宜宿主体内虫体，雌虫长度长于雄虫（Wistar大鼠例外）。适宜宿主（黄牛、山羊、BALB/c小鼠和新西兰大白兔）感染后肝脏布满虫卵结节，其中山羊、新西兰大白兔和BALB/c小鼠的肝脏完全充满白色虫卵结节，病变尤其严重；而非适宜宿主的肝脏只有少量虫卵结节（水牛），或者几乎看不到虫卵结节（Wistar大鼠）。本文首次对日本血吸虫感染黄牛、水牛和山羊三种天然宿主后宿主的肝脏组织病理变化差异及三种宿主来源虫体的超微结构作了比较，观察到适宜宿主黄牛和山羊的肝脏组织产生了更为强烈的免疫应答，肝细胞肿大，炎性细胞明显增多且聚集，虫卵周围有大量嗜酸性细胞、炎性淋巴细胞聚集浸润，或呈浸润性坏死，形成典型条纹状嗜伊红沉淀物，呈现特征性“何博礼现象”；而水牛组的肝细胞以中央静脉为中心,呈放射状排列,无明显肝细胞变性、无大量坏死及炎症细胞的聚集浸润,小叶结构完整，白细胞少于红细胞，呈散在分布，且以中性粒细胞和单核细胞居多，淋巴细胞很少。虫体超微结构观察结果表明不同宿主来源虫体在超微结构水平亦存在较大差异。扫描电镜观察显示水牛组雄虫口吸盘皱缩，松弛，腹吸盘外边缘体棘宽度减小，体棘较不明显，雄虫抱雌沟后段褶嵴扁平，花型乳突较少，且呈空泡状；雌虫口吸盘萎缩，退化性变化，口吸盘背部体棘，感觉乳突退化，体壁无褶嵴，仅有少量乳突。而山羊组和黄牛组的雄虫体表主要部位在扫描电镜观察下较正常，腹吸盘感觉乳突丰富，雄虫外壁示褶嵴和感觉乳突，抱雌沟体壁褶嵴明显，花型乳突丰富；雌虫口吸盘感觉乳突和体棘丰富，腹吸盘及生殖孔明显，体壁褶嵴明显和乳突较多。透射电镜观察显示水牛组来源的雄虫体壁有较多空泡结构，内部脂滴明显增多，胞质内细胞器溶解；水牛组来源的雌虫体壁与黄牛雌虫体壁相差不大，但内部微绒毛结构较短，较少。2．天然宿主黄牛和水牛感染日本血吸虫后的免疫应答初步研究对黄牛和水牛感染日本血吸虫前后免疫学应答差异进行了比较分析，感染前和感染后，黄牛的CD4+T细胞比例一直高于水牛；而水牛的CD8+T细胞比例一直显著高于黄牛。在感染血吸虫尾蚴后，黄牛的CD4+T细胞比例下降，水牛的CD8+T细胞比例升高，黄牛和水牛的CD4/CD8比率都下降。黄牛的IFN-γ比例在感染前至感染后4w较高，至感染后7w时显著下降至较低水平；黄牛IL-4比例在感染前至感染后2w很低，感染4w后稍有升高，至感染7w时继续升高。水牛的IFN-γ比例在感染前较低，感染2w后有升高，之后至感染7w时都呈下降趋势；水牛的IL-4比例在感染前较高，感染之后一直下降，至7w时降至一个很低水平。应用ELISA检测感染前和感染后2w，4w，7w的血清特异IgG抗体，结果显示黄牛组在感染之后特异IgG抗体水平逐渐增加，并显著高于水牛，而水牛组特异性抗体应答启动较慢，至感染后7w，特异性IgG抗体仍处于较低水平。研究结果表明黄牛在感染早期以Th1类主导的免疫应答为主，感染6-7w后转向以Th2类主导的免疫应答为主，而水牛在感染之后则没有Th1向Th2漂移的明显变化。同时提示宿主CD4+T细胞主导的免疫环境的差异可能是黄牛比水牛更有利于虫体发育的重要原因之一。本研究也为今后牛用血吸虫疫苗免疫设计提供了科学依据。3.不同天然宿主来源的日本血吸虫基因表达谱分析利用寡核苷酸基因芯片技术分析黄牛、水牛和山羊三种天然保虫宿主来源的日本血吸虫基因表达差异。芯片总体分析结果表明，水牛来源虫体与黄牛来源虫体，有66个差异表达基因（p<0.05, FC>2），水牛来源虫体与山羊来源虫体有491个差异表达基因（p<0.05, FC>2），其中共同的差异表达基因有46个。在非适宜宿主水牛组来源虫体上调表达的基因主要有：蛋白磷酸酶/蛋白激酶类（PP2A，CDK6），神经调节相关基因（protocadherin, Rab3interactingmolecule–related, lim-homeobox family transcription factor），发育相关基因（iroquois homeoboxfamily transcription factor，lim-homeobox family transcription factor)，核苷酸代谢相关基因（NDK6,EIF3, histone h4-like, Pumilio），超长链脂肪酸延伸酶（elongase of very long chainfatty acids），凋亡诱导基因(TSP-1)，Wnt信号通路基因（beta-catenin-like protein，wnt-related）等；而在水牛组来源虫体下调表达的基因主要有：细胞结构组成相关基因（spectrin, ciliaryrootlet, cell wall protein，gamma-tubulin complex, macroglobulin, eggshell protein），凋亡有关的蛋白激酶类（tyrosine-protein kinase, serine threonine protein kinaseAkt, MAPK/ERK kinase4,MAPK/ERK kinase1），繁殖和胚胎发育相关的Dlx同源蛋白（distal-less/Dlx homeobox），神经调节有关基因（taurine transporter, glutamate receptor, glutamic acid-rich protein），表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor），多功能的亮氨酸富集重复区极性蛋白（leucine-rich repeat protein scribble complex protein）和锌指蛋白等。值得我们感兴趣的是，第一，一些与凋亡相关的蛋白激酶在适宜宿主山羊来源虫体中上调表达，而凋亡诱导基因TSP1在非适宜宿主水牛来源虫体中上调表达，提示凋亡途径可能是虫体在不同宿主环境中发育差异的重要原因之一。第二，一些与神经调节相关的基因在不同适宜性宿主来源虫体呈现差异表达，提示神经调节可能是血吸虫适应不同适宜性宿主环境的一个重要因素。第三，一些发育相关基因和细胞结构组成相关基因在不同适宜性宿主来源虫体呈现差异表达，是因为日本血吸虫感染三种不同适宜性天然动物宿主后导致了不同的发育结果。对差异表达基因信号通路途径分析显示，这些差异表达基因主要参与核苷酸代谢、脂肪代谢、能量代谢、遗传信息加工、免疫系统和Wnt信号通路等。本文结果提示这些差异表达基因可能对虫体的生长和发育甚为重要，值得进一步的关注。本文首次对黄牛、水牛和山羊三种不同天然宿主来源的血吸虫差异表达基因进行了比较分析，为从转录组水平分析、鉴定可能影响日本血吸虫生长发育的重要虫源性分子及筛选家畜用血吸虫病疫苗候选分子提供了基础。4.黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血基因表达谱分析本文利用牛的全基因组芯片对黄牛、水牛血吸虫感染前后的外周血整体基因表达谱进行比较分析。结果表明，感染前两种宿主的基因表达谱存在较大差异，有差异表达基因5740个，其中4185个在感染7w后仍存在，占72.9%。在日本血吸虫感染7w后，两宿主产生了更多的差异表达基因（共6353个），其中有2168个是新呈现的差异表达基因。感染前后，黄牛和水牛共有的差异表达基因较少，只有83个。适宜宿主黄牛感染前后总差异表达基因497个，特有差异表达基因390个（黄牛出现，而水牛没有出现），占总差异表达基因的78.5%。在日本血吸虫感染后，非适宜宿主水牛呈现了更多的基因表达差异，水牛感染前后总差异表达基因有2197个，特有差异表达基因2114个（水牛出现，而黄牛没有出现），占总差异表达基因96.2%。对两种宿主在感染7w后新呈现的差异表达基因作进一步分析表明，这些差异表达基因主要与免疫系统及免疫调节通路（尤其是先天免疫系统及调节通路，包括补体级联及凝血系统，自然杀伤细胞介导的细胞毒性，Toll样受体信号途径等），造血细胞，p53通路，嘌呤代谢等有关，且这些大都为水牛显著下调表达基因。本研究提示一些水牛和黄牛先天存在或感染血吸虫后新呈现的差异表达基因可能影响了日本血吸虫的生长发育。5.不同宿主来源虫体的微卫星分析及特征性差异表达基因的筛选验证用同一地理株（中国大陆安徽株）日本血吸虫尾蚴感染黄牛、水牛、山羊、Wistar大鼠、BALB/c小鼠、新西兰大白兔六种宿主，从已有日本血吸虫微卫星研究相关文献中寻找设计了7对微卫星检测引物，利用微卫星技术对这六种不同宿主来源的日本血吸虫进行遗传多态性分析。结果该法未能在不同宿主来源虫体中寻找到明显的遗传变异标记，唯有其中一对引物的谱系聚类分析能够初步将实验动物宿主与天然宿主来源虫体分开。对黄牛、水牛和山羊三种天然宿主来源虫体的寡核苷酸基因芯片数据进行分析和实时定量法验证，获得2个黄牛，3个水牛，5个山羊来源虫体的特征性差异表达基因，它们可能可以作为三种保虫宿主来源虫体的特征性分子标记。本文首次对黄牛、水牛和山羊三种不同宿主来源虫体的基因表达差异及黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血基因表达差异进行了比较分析，获得一批可能对血吸虫生长发育至关重要的虫源性和宿主源性分子，为揭示黄牛和水牛对血吸虫感染差异的分子基础，探讨不同适宜性宿主，特别是我国日本血吸虫病最重要天然宿主牛、羊与日本血吸虫相互作用关系积累了有价值的信息和知识，为筛选家畜用日本血吸虫疫苗候选分子或新药物靶标提供了新思路。