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背景:卵巢癌细胞耐药是卵巢癌治疗的关键问题,研究组前期工作发现,在卵巢癌顺铂耐药细胞中p62高表达,可以诱导自噬,自噬通过缓解内质网应激降低了对顺铂的敏感性,从而导致卵巢癌细胞对顺铂耐药。可见肿瘤细胞的存活与死亡之间的失衡是导致肿瘤细胞耐药的主要原因。有研究表明,NF-κB能够促进肿瘤细胞的生存,p62能够通过与TRAF6结合参与这个过程。此外p62在结构上存在泛素相关结构域,从而能够与K48-多聚泛素链和K63-多聚泛素链相结合,因此p62不仅可以通过自噬途径帮助泛素化蛋白降解,也能够通过与多聚泛素化链相结合,与其他开关蛋白相互作用,发挥促存活或者促凋亡的双重作用。已有研究证实,p62与开关蛋白RIP1有相互作用位点。RIP1不仅能够活化NF-κB促进细胞的生存,也能够活化caspase-8,发挥调节细胞凋亡的作用。目的:本实验从p62影响RIP1的泛素化、进而参与NF-κB信号途径活化的角度,深入探讨人卵巢癌细胞耐药的机制。方法:以人卵巢癌细胞株即SKOV-3细胞及其子代人卵巢癌顺铂耐药细胞株即SKOV-3/DDP细胞为研究对象,顺铂作用于两种细胞,通过小干扰RNA抑制p62蛋白表达。利用MTT法检测两种细胞存活率;利用倒置光学显微镜及全自动显微镜数码系统,观察并拍摄两种细胞形态学方面变化;采用蛋白质印记(Western Blot)法,提取两种细胞总蛋白检测RIP1、p62蛋白表达变化,提取核蛋白检测NF-κB(p50)、NF-κB(p65)、磷酸化IκBα(p-IκBα)和IκBα蛋白表达,定量p-IκBα/IκBα蛋白比值,分析NF-κB活化情况;通过免疫荧光法,观察细胞中NF-κB(p65)的入核情况;通过免疫共沉淀法,检测细胞中RIP1的泛素化形式的变化。结果:1)与SKOV-3细胞比较, SKOV-3/DDP存活率较高,在顺铂作用24h后,部分细胞变圆显漂浮状态;而SKOV-3细胞几乎全部死亡。表明SKOV-3/DDP细胞较SKOV-3细胞对顺铂有更强的抵抗性。2)与SKOV-3细胞比较,p62蛋白在SKOV-3/DDP细胞中高表达,顺铂作用下,p62蛋白表达水平降低;RIP1蛋白在SKOV-3/DDP细胞中高表达,顺铂作用下,其变化不明显。3)与SKOV-3细胞比较,顺铂作用12h和24h,SKOV-3/DDP细胞核蛋白NF-κB(p50)和(p65)表达增加,p-IκBα蛋白表达增加,p-IκBα/IκBα蛋白比值增加,NF-κB(p65)蛋白在细胞核内免疫荧光增加。4)与SKOV-3细胞比较,顺铂作用下,SKOV-3/DDP细胞RIP1的K63泛素化表达高,RIP1的K48泛素化降低,均存在时间依赖性。5)抑制p62蛋白表达,SKOV-3/DDP细胞中的RIP1K63泛素化显著降低,RIP1K48泛素化显著增加,NF-κB活化程度和细胞存活率也降低。结论:(1)在SKOV-3细胞和SKOV-3/DDP细胞中p62、RIP1蛋白表达存在差异,表明p62、RIP1可能与顺铂耐药有关。(2)顺铂作用下,SKOV-3/DDP细胞中RIP1的泛素化形式是决定NF-κB信号通路活性的原因之一。(3)人卵巢癌顺铂耐药细胞中,p62可能通过调控RIP1的泛素化形式,参与活化NF-κB信号途径,促进了肿瘤细胞耐药的形成。