论文部分内容阅读
1背景与目的:紫杉醇耐药已成为卵巢癌患者预后差、死亡率高的重要原因。目前已证实,在卵巢癌中TLR4/MyD88信号通路与肿瘤进展及紫杉醇耐药密切相关。脂多糖(Lipopolysaccharide LPS)、紫杉醇可与TLR4结合,活化MyD88,从而导致蛋白激酶C(Akt/PKC)的激活,并进一步引起NF-B的活化,产生促炎因子,影响卵巢上皮癌的凋亡。我们课题组前期研究表明,MyD88的高表达可作为卵巢癌患者的生存期较短的独立预后因素,但是MyD88仅在人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3中表达,在人卵巢癌紫杉醇敏感细胞株A2780中不表达。在MyD88活化的过程中,髓样分化蛋白2(MD-2)介导的TLR4/MD2复合物的形成是必不可少的。白术内酯I(Atractylenolide I,AO-1)是从白术中分离的倍半萜内酯,有抗炎、抗肿瘤作用。我们在前期的研究中亦发现,AO-1作为TLR-4的拮抗性配体,具有类似于LPS或紫杉醇的结合位点,显著下调MyD88阳性卵巢癌细胞(SKOV3细胞株)中TLR-4/MyD88信号通路介导的VEGF和Surivin的表达以及紫杉醇抵抗。提示AO-1可能通过阻断TLR-4/MyD88信号通路使卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性增加,其具体分子机制及作用靶点仍不清楚。但我们通过计算机初步对接分析表明,AO-1和紫杉醇均可结合MD2,紫杉醇与MD2结合后促使TLR4/MD2复合物的形成,但AO-I可拮抗与MD2疏水结构域结合的紫杉醇,表明AO-I诱导的MD2构象的改变可能阻碍了TLR4/MD2复合物的形成,从而使TLR4信号灭活,抑制了MyD88的活化,从而影响下游细胞因子的分泌。为了进一步证实白术内酯I靶向MD2拮抗TLR-4/MyD88/Akt通路从而增加紫杉醇诱导的卵巢癌细胞的凋亡效应,本课题应用流式细胞技术、Western blot等方法初步研究其发生机制,以期为卵巢癌化疗耐药的治疗奠定基础。2实验方法2.1采用流式细胞仪检测不同浓度紫杉醇、LPS、AO-1以及AO-1联合不同浓度紫杉醇或LPS对人卵巢癌SKOV-3细胞中TLR4/MD2复合物形成的作用。2.2采用Western Blot检测紫杉醇、LPS、AO-1以及AO-1联合紫杉醇或LPS对人卵巢癌SKOV-3、A2780细胞凋亡相关调节分子Akt和pAkt表达的作用。2.3采用流式细胞仪检测紫杉醇、LPS、AO-1以及AO-1联合紫杉醇或LPS对人卵巢癌SKOV-3、A2780细胞凋亡率的影响。3、结果3.1LPS及不同浓度紫杉醇作用于MyD88阳性卵巢癌细胞SKOV-3后,细胞膜表面TLR4/MD2复合物的荧光信号明显增加,且随紫杉醇浓度增大而增加。白术内酯I单独作用于SKOV-3细胞株后TLR4/MD2复合物的荧光信号无明显变化。然而白术内酯I联合LPS,或联合不同浓度紫杉醇时,与单用LPS、紫杉醇相比,TLR4/MD2复合物的荧光信号明显下降。3.2紫杉醇、白术内酯I、LPS、白术内酯I联合紫杉醇及白术内酯I联合LPS对SKOV-3细胞作用的24h内总Akt的表达无明显的变化。紫杉醇、LPS作用SKOV-3细胞24h内磷酸化的Akt(pAkt)表达明显上调,且随时间延长上调水平越明显。白术内酯I、白术内酯I联合紫杉醇、白术内酯I联合LPS作用SKOV-3细胞后磷酸化的Akt(pAkt)表达明显下降,且与单用LPS、紫杉醇相比,pAkt表达显著下调。而在A2780细胞中紫杉醇、白术内酯I、LPS、白术内酯I联合紫杉醇及白术内酯I联合LPS作用的24h内总Akt、磷酸化的Akt(pAkt)的表达无明显的变化。3.3在A2780细胞中,白术内酯I、LPS或白术内酯I联合LPS作用24h、48h后,凋亡率无明显改变,紫杉醇或白术内酯I联合紫杉醇作用A278024h、48h后,凋亡率增加,但单独用药及联合用药之间凋亡率差异无统计学意义。在SKOV-3细胞中,白术内酯I、LPS作用24h、48h后,凋亡率无明显改变,白术内酯I联合LPS凋亡率稍有增加,紫杉醇、白术内酯I联合紫杉醇作用24h、48h后,凋亡率增加,且联合用药较单用紫杉醇时凋亡率明显增高。4、结论紫杉醇作用于SKOV-3细胞后,细胞表面TLR4/MD2复合物的形成明显增加,磷酸化的Akt(pAkt)表达明显上调,当紫杉醇与AO-1联合使用时,TLR4/MD2复合物的形成明显降低,下调了pAkt的表达,同时肿瘤细胞凋亡率较单用紫杉醇时明显升高。但在A2780细胞株中,TLR4/MD2复合物形成,Akt、pAkt表达,及凋亡率未见明显差异。提示AO-1极有可能通过靶向MD2,抑制紫杉醇诱导的TLR4/MD2复合物的形成,从而阻断TLR-4/MyD88/Akt信号通路的传导,增加了紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡,增加了卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性和细胞毒作用。