背景烧伤至今依然是全球性的重大健康和安全难题,而对原发组织损伤的处理和间生态烧伤创面转归的介入,是烧伤早期治疗的重要内容。深二度及以上烧伤创面表皮大部分损毁,伤后主要来源于创面周边的成纤维细胞活化、增殖、迁移,分泌胶原、纤维连接蛋白等构成新的细胞外基质,填补创面缺损,同时收缩伤口面积。成纤维细胞是深度烧伤创面愈合进程中重要的功能细胞,可受到多种局部或循环中的细胞因子刺激和调控。多项以正常动物个体作为受体,输注烧伤模型动物个体血浆的报道均显示,烧伤血浆与组织发生血管通透性升高、水肿等烧伤后特征性不良变化密切相关,其具体物质及作用机制尚不明确,对此研究人员提出了“烧伤循环因子”这一概念,用于表述烧伤后产生并存在于循环中,可进一步造成组织烧伤后特征性表现的物质。外泌体是直径在30-150 nm之间的双磷脂层细胞外囊泡,可运输核酸、蛋白或脂质分子,通过体液循环进行细胞间的信息和物质交流,不同生理或病理情况下特异性表达的外泌体,是多种疾病早期诊断及判断预后极具潜力的生物标志物。微小RNA（micro RNA,mi RNA）是外泌体的常见内容物,为长度约19~25个碱基的短单链非编码RNA分子,循环mi RNA一般通过与Ago2等蛋白结合,或以封装在外泌体等微泡中的方式,避免环境中RNA酶的降解。烧伤早期病人血浆外泌体mi RNA的相关研究尚未见报道。严重烧伤病人皮肤组织遭受直接热力损伤,同时机体应激后全身状态剧烈变化,多种细胞被激活并可能生成释放大量血浆外泌体,成为烧伤循环因子家庭的一员,通过通透性显著升高的微血管屏障渗出,其特异性的mi RNA表达,可能对烧伤创面皮肤组织的伤后变化和转归产生影响。目的描绘严重烧伤早期病人血浆外泌体微小RNA表达谱,筛选差异表达mi RNA并预测其皮肤组织相关靶基因,研究关键mi RNA/m RNA调控轴对人真皮成纤维细胞增殖、迁移、细胞周期和分泌等功能的影响及其机制。方法本研究主要分为两个部分,第一部分研究为严重烧伤早期血浆外泌体小RNA测序,筛选出差异表达mi RNA后,联合基因表达数据库进行生物信息学分析,构建血液-组织互作中的关键mi RNA/m RNA调控网络。（1）收集严重烧伤后4-7天病人和健康志愿者血液标本,提取并鉴定血浆外泌体,二代测序描绘小RNA表达谱,计算各mi RNA表达量并筛选出差异表达mi RNA（Differentially expressed micro RNAs,DEMs）,在mir DIP数据库中预测DEMs的靶基因。（2）在基因表达综合数据库GEO数据库（Gene expression omnibus）中,选取记录了烧伤后4-7天病人深度烧伤皮肤和正常皮肤基因表达矩阵的GSE8056数据集。以FDR＜0.05且|log2FC（fold change）|≥1的标准,从微阵列芯片基因表达数据中筛选出差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）。（3）对烧伤后早期血浆外泌体DEMs的靶基因和深度烧伤皮肤DEGs进行横向对比,二者重合部分的基因,即为可能形成烧伤后血液-组织间互作中的本研究关注基因,生物信息学方法对关注基因进行功能作用和涉及通路的富集分析。（4）基于STRING数据库构建关注基因的蛋白互作网络（Protein-protein interaction network,PPI network）,根据网络中节点的连接度（degree）值筛选出关键基因和其在DEMs中的上游mi RNA。多对关键mi RNAm RNA调控轴构建出烧伤后早期可能的血液-组织互作网络。第二部分为研究hsa-mi R-718/CCNB1调控轴对人真皮成纤维细胞增殖、迁移、细胞周期和分泌等功能的影响及其机制。（1）收集严重烧伤后4-7天病人和健康志愿者血液标本,提取血浆外泌体mi RNA,采用微滴式数字PCR（Droplet digital PCR,dd PCR）验证hsa-mi R-718、hsa-mi R-6754-3p和hsa-mi R-4754的差异表达情况。（2）培养人真皮成纤维细胞,建立hsa-mi R-718过表达和沉默细胞模型。对照组和实验组根据转染情况,分为未经任何转染操作的control组,转染模拟物过表达hsa-mi R-718的mimics组,转染模拟物细胞的阴性对照mimics NC组,转染抑制物抑制hsa-mi R-718表达的inhibitor组,以及转染抑制物细胞的阴性对照inhibitor NC组。（3）检测各组细胞人真皮成纤维细胞的生物学行为的改变。通过CCK8实验检测人真皮成纤维细胞的细胞活力;采用细胞划痕试验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况、细胞周期分布和增殖指数。（4）在Target Scan数据库中预测hsa-mi R-718和CCNB1的靶向结合位点。采用双荧光素酶基因报告实验,构建CCNB1 3’UTR野生型和突变型基因报告质粒载体,检测验证hsa-mi R-718对荧光素酶活性的影响,以验证hsa-mi R-718与CCNB1的直接结合。使用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-q PCR）确定hsa-mi R-718对CCNB1m RNA表达的调控方向。（5）采用蛋白免疫印迹实验（Western blot,WB）检测人真皮成纤维细胞中hsa-mi R-718对CCNB1蛋白表达水平,PI3K/Akt信号通路的标志性蛋白磷脂酰肌醇激酶3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase,PI3K）、Akt的总蛋白以及磷酸化的Akt蛋白（p-Akt）表达水平,以及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和I型胶原蛋白（collagen I）分泌水平的影响。结果第一部分:（1）透视电镜、纳米颗粒跟踪分析和蛋白质免疫印迹实验检测证明烧伤后早期血浆外泌体的存在。二代测序显示血浆外泌体富含小RNA,且其中成熟mi RNA占据多数地位,比例为16.05%。以FDR＜0.05且|log2FC（fold change）|≥1的标准,共筛选出85个显著差异表达的mi RNA,包含14个下调的mi RNA和71个上调的mi RNA。所有DEMs共计预测到12901个靶基因。（2）GSE8056微阵列芯片基因表达矩阵数据分析结果显示,以FDR＜0.05且|log2FC（fold change）|≥1为标准,与对照组正常皮肤相比,深度烧伤创面皮肤组织共有1861个显著差异表达基因,包含831个上调基因和1030个下调基因。（3）DEMs靶基因和DEGs之间的交集共1058个关注基因。富集分析中基因本体（Gene Ontology,GO）分析前10的条目为:免疫受体活性、细胞外基质结构成分、糖类结合、细胞因子活性、糖胺聚糖结合、硫化合物结合、细胞因子受体活性、细胞因子结合、肝素结合和纤维连接蛋白结合等。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes,KEGG）分析结果共提示7条通路:细胞粘附分子、细胞周期、谷胱甘肽代谢、细胞外基质-受体相互作用、造血细胞系和JAK-STAT信号通路等。（4）关注基因的PPI网络中筛选出9个关键基因——CDK1、CCNB1、CCNA2、BUB1B、PLK1、KIF11、AURKA、NUSAP1和CDCA8。作为靶基因其DEMs中上游关键mi RNA共16个,包括4个下调的mi RNA——hsa-mi R-6848-3p、hsa-mi R-4684-3p、hsa-mi R-4786-5p和hsa-mi R-365a-5p;以及12个上调的mi RNA——hsa-mi R-6751-3p、hsa-mi R-718、hsa-mi R-4754、hsa-mi R-6754-3p、hsa-mi R-4739、hsa-mi R-6739-5p、hsa-mi R-6884-3p、hsa-mi R-1224-3p、hsa-mi R-6878-3p、hsa-mi R-6795-3p、hsami R-550a-3p和hsa-mi R-550b-3p。最终构建出20对mi RNA-m RNA调控轴,形成烧伤后早期机体可能的血液-组织互作网络。第二部分:（1）严重烧伤后早期血浆外泌体中hsa-mi R-718、hsa-mi R-6754-3p和hsa-mi R-4754的表达较正常对照组均有显著差异（均P＜0.05）,且其中hsa-mi R-718的表达量总体偏高,更适合于探究其对局部烧伤皮肤组织的可能影响。（2）CCK8实验显示hsa-mi R-718可以抑制人真皮成纤维细胞的细胞活力（P＜0.001）。细胞划痕实验显示在12h和24h时间点,过表达hsa-mi R-718的人真皮成纤维细胞迁移率显著降低（均P＜0.0001）;而抑制hsa-mi R-718表达则细胞迁移率显著增高（均P＜0.0001）。流式细胞术细胞凋亡检测显示,过表达hsa-mi R-718可以诱导人真皮成纤维细胞的凋亡,造成其凋亡细胞比例,包括早期凋亡细胞比例和晚期凋亡细胞比例均显著升高（分别P＜0.001,P＜0.05和P＜0.05）;而抑制hsa-mi R-718表达其凋亡细胞比例和晚期凋亡细胞比例均明显降低（均P＜0.01）,但早期凋亡细胞比例无明显差异（P＞0.05）。流式细胞术细胞细胞周期检测显示,过表达hsa-mi R-718可以诱导人真皮成纤维细胞G0/G1期细胞比例显著增高（P＜0.001）,S期细胞比例无明显变化（P＞0.05）,G2/M期细胞比例显著降低（P＜0.01）,细胞增殖指数显著下降（P＜0.001）;抑制hsa-mi R-718表达时G0/G1期细胞比例显著降低（P＜0.001）,S期细胞比例无明显变化（P＞0.05）,G2/M期细胞比例显著增高（P＜0.01）,细胞增殖指数显著升高（P＜0.0001）。（3）双荧光素酶基因报告实验结果显示,与mimics NC组相比,hsa-mi R-718 mimics与CCNB1野生型质粒共转染组荧光素酶活性表达显著下调（P＜0.0001）;而hsa-mi R-718 mimics与CCNB1 3’UTR端突变型质粒共转染组荧光素酶活性表达无明显变化（P＞0.05）,即hsa-mi R-718可以与CCNB1 m RNA的3’UTR端直接靶向结合。RT-q PCR结果则显示,过表达hsa-mi R-718可以显著抑制CCNB1 m RNA的表达（P＜0.001）。（4）WB检测进一步确认表明hsa-mi R-718可以显著抑制CCNB1蛋白水平的表达（P＜0.001）。同时mimics组α-SMA和collagen I的蛋白表达量显著低于mimics NC组（分别P＜0.01和P＜0.0001）;而inhibitor组α-SMA和collagen I的蛋白表达量则显著高于inhibitor NC组（均P＜0.0001）,即hsa-mi R-718可以抑制成纤维细胞α-SMA和collagen I的分泌。另外,mimics组PI3K和p-Akt的蛋白表达量显著低于mimics NC组（分别P＜0.001和P＜0.0001）;而inhibitor组PI3K和p-Akt的蛋白表达量则显著高于inhibitor NC组（均P＜0.0001）;二者Akt总蛋白表达量无明显差异。结论（1）严重烧伤早期病人血浆外泌体mi RNA表达谱,以及深度烧伤皮肤组织基因表达谱均发生明显改变,且外泌体差异表达mi RNA的靶基因与皮肤组织差异表达基因具有较高重合度。二者构建的mi RNA-m RNA调控轴网络,可能形成丰富的血液-组织互作。（2）严重烧伤后早期血浆外泌体中hsa-mi R-718显著高表达。Hsa-mi R-718可以直接靶向结合CCNB1 m RNA的3’UTR端,下调CCNB1的表达,并可能通过抑制PI3K/Akt信号通路关键蛋白的表达和Akt的磷酸化过程,抑制PI3K/Akt信号通路的激活,进而抑制人真皮成纤维细胞的细胞活力、增殖、迁移,引发细胞周期的G0/G1期阻滞,诱导细胞凋亡,同时抑制α-SMA和collagen I的分泌,阻碍创面的修复进程。