乙酸乙酯作为我国白酒中最重要的风味化合物之一,在白酒中有着举足轻重的呈香作用。适量的乙酸乙酯可以赋予白酒柔和的口感,含量过高会破坏酒体的平衡,产生不愉快的气味,然而含量过低会使白酒的风味寡淡。在白酒酿造过程中,酯类物质通常是由酵母代谢产生。为了深入理解酿酒酵母乙酸乙酯合成的分子机制,本实验以工业酿酒酵母AY12的单倍体a45为亲本菌株,通过过表达或者敲除酯合成酶相关基因EAT1、ATF1、ATF2、EEB1、EHT1和IMO32,模拟白酒发酵工艺,解析这些基因对乙酸乙酯合成的影响,主要研究内容如下:（1）构建单独过表达酯合成酶相关编码基因EAT1和ATF1的重组菌株。在出发菌株a45的Gal80位点使用组成型强启动子PGK1p和终止子PGK1t分别对酯合成酶相关编码基因EAT1和ATF1进行整合过表达,得到重组菌株a45-PEAT1和a45-PATF1菌株。玉米水解液发酵结果显示亲本菌株的乙酸乙酯产量为8.65 mg/L,重组菌株a45-PEAT1和a45-PATF1的乙酸乙酯产量分别为20.93 mg/L和183.73 mg/L,比亲本菌株提高了1.42倍和20.24倍。结果显示,过表达EAT1和ATF1基因均能显著提高乙酸乙酯的含量。（2）构建单独敲除酯合成酶相关基因EAT1、ATF1、ATF2、EEB1、EHT1和IMO32的重组菌株。利用同源重组的方法,分别敲除出发菌株a45的酯合成酶相关基因EAT1、ATF1、ATF2、EEB1、EHT1和IMO32。玉米浓醪发酵结果显示,亲本菌株的乙酸乙酯产量为31.83 mg/L,重组菌株a45ΔEAT1、a45ΔATF1、a45ΔATF2、a45ΔEEB1、a45ΔEHT1和a45ΔIMO32的乙酸乙酯产量分别为32.13 mg/L、33.12 mg/L、32.97 mg/、32.84 mg/L、31.89 mg/L和33.39 mg/L,与亲本菌株a45无显著性差异。RT-PCR实验证实单敲除菌株中相对应基因不表达,然而其他的部分酯合成酶相关基因的表达水平有不同程度提高,这种回补效应也许是单敲除突变株乙酸乙酯产量无显著变化的主要原因。（3）构建酯合成酶相关基因组合敲除菌株。利用Cre-loxp循环编辑技术,构建了双敲菌株a45-W2（ΔEAT1ΔATF1）、三敲菌株a45-W3（ΔEAT1ΔATF1ΔATF2）、四敲菌株a45-W4（ΔEAT1ΔATF1ΔATF2ΔEEB1）、五敲菌株a45-W5（ΔEAT1ΔATF1ΔATF2ΔEEB1ΔEHT1）和六敲菌株a45-W6（ΔEAT1ΔATF1ΔATF2ΔEEB1ΔEHT1ΔIMO32）。玉米浓醪发酵实验显示,双敲菌株和三敲菌株的乙酸乙酯产量无显著变化,而突变株a45-W4、a45-W5和a45-W6的乙酸乙酯产量分别降低了8.5%、16.27%和18.63%。在玉米浓醪发酵条件下,乙酸和乙醇通过化学反应生成的乙酸乙酯仅为5.97 mg/L,远远低于六敲突变株乙酸乙酯的产量。这些结果表明酿酒酵母中存在未知的乙酸乙酯合成途径。