研究背景及意义胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,在发展中国家,尤其是东亚、东欧和南美,每年有超过70%的新发病例和死亡病例。在中国,胃癌已成为恶性肿瘤中发病率第二位的肿瘤。尽管一些胃癌患者的恶性肿瘤能够完整切除,他们仍然预后不良,5年生存率只有20-30%。多数胃癌患者在确诊时,肿瘤已经发展到了进展期,而丧失了手术机会,这些患者的中位生存时间通常不到一年。虽然多种新型抗肿瘤药物和改良的手术方式不断涌现,胃癌尤其是晚期胃癌,仍然是一个无法克服的难题。胃癌患者高死亡率主要是由于肿瘤的复发和转移,而这个过程是一个与多因素诱发、多基因改变、多步骤参与的病理生理过程。因此,研究胃癌发病的分子学机制,控制胃癌的发生发展刻不容缓。RLIP76是一个76-kDa的剪接变异体,由人类基因RalBP1(18p11.22)编码。它是一个Ral结合蛋白,也被称为RalBP1。最初,RLIP76被认为是一个RalGTP酶效应蛋白,衔接Ral和Rho通路。它参与ATP的水解,将多种物质,如谷胱甘肽结合物(GS-E)和化疗药物运输出细胞。RLIP76是Ras家族的成员之一,Ras有多种下游信号蛋白分子,如VEGF,而且Ras的活化在人类恶性肿瘤的病理生理过程中起着不可或缺的作用。在细胞的生命过程中,Akt信号通路是一个基本的信号传递轴,在调节细胞的生存及凋亡方面发挥着重要作用,而Akt也是Ras信号通路的下游分子。早期针对RLIP76的研究主要集中于其对物质转运的影响,目前越来越多的研究发现它在一系列的细胞生物学过程中发挥着重要作用。它参与形成多功能蛋白复合体,例如有丝分裂纺锤体和EGF、TGF-β等受体信号复合物,调节细胞的有丝分裂、增殖、分化、凋亡和内吞过程,并且在受体-配体的信号转导过程中起决定性的作用。研究表明,RLIP76在人体多种组织中均有表达,如肝脏、心脏、卵巢、肺脏、肌肉和肾脏。而在很多恶性肿瘤中,其表达明显升高,且与肿瘤的放化疗敏感性有密切关系。在结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR中,敲除RLIP76能够增加细胞对长春新碱的敏感性,使长春新碱的IC50降低。在乳腺肿瘤中,RLIP76的表达与肿瘤的恶性程度呈正相关,与患者生存率呈负相关。动物实验中,用抗体和RNAi阻断RLIP76,能够改善恶性肿瘤对化疗和放疗的敏感性,并能缩小非小细胞肺癌、结肠癌、前列腺癌和B16黑色素瘤等实体瘤的体积。同时,体外细胞培养实验证实,敲除或阻断RLIP76可诱导小细胞肺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、淋巴瘤细胞和粒细胞性白血病细胞等多种组织来源的细胞发生凋亡。这些数据提示我们,将RLIP76作为治疗靶点是抗肿瘤治疗的一个新方向。基于以往研究,我们推测RLIP76在胃癌的发生发展中可能发挥着举足轻重的作用。因此,本研究首先观察了 RLIP76在胃癌组织中的表达水平,然后通过慢病毒干扰实验探讨了其对胃癌细胞功能的影响及机制。研究结果表明,与胃部良性肿瘤胃粘膜相比,胃癌组织中RLIP76的表达明显升高;与相应的癌旁组织相比,RLIP76在胃癌组织中的表达水平明显升高,并与患者的预后不良显著相关。通过慢病毒转染敲除胃癌细胞系SGC7901和MGC803中的RLIP76后,发现这些细胞的增殖显著减慢,细胞凋亡显著增加,血管形成显著减少。最后,我们检测了 RLIP76敲除后Akt/mTOR信号通路的变化,发现Akt和mTOR的磷酸化水平明显降低。本研究结果证实,RLIP76通过调节Akt/mTOR信号通路的磷酸化水平调节胃癌的恶性转化,该结果为其作为胃癌的治疗靶点提供了理论基础,开辟了新思路,具有潜在的实际临床应用价值。第一部分RLIP76在胃癌中的表达及临床意义目的:1.观察RLIP76在正常胃粘膜,胃癌及癌旁组织中的表达情况2.分析RLIP76在胃癌中的表达变化与多种临床指标的相关性方法:1.选取2013年1月到2014年1月期间,于山东省立医院手术治疗的76例胃癌患者手术标本,中位年龄46岁,同时选取40例胃部良性肿瘤患者的胃粘膜标本作为阴性对照。另外收集2009年2月到2010年7月期间于山东省立医院手术治疗的114例胃癌患者的癌组织及癌旁组织标本,其中男性69例,女性45例,并收集患者的临床资料。2.将收集的所有手术标本进行免疫组化染色,并进行评分,研究RLIP76不同表达水平,联合患者的临床资料,用SPSS17.0建立数据库,Kaplan-Meier法进行生存因素分析,绘制生存函数曲线。用卡方检验评估RLIP76与年龄、性别、淋巴结转移、TNM分期等各临床指标的关系。结果:1.76例胃癌组织标本和40例胃部良性肿瘤患者胃粘膜标本染色中,胃癌组织中的RLIP76的表达水平明显高于胃粘膜表达水平。2.114例胃癌组织RLIP76的免疫组化染色中,有53例RLIP76阳性表达,61例呈中-低(阴性)表达。卡方检验显示,RLIP76的表达水平与淋巴结转移、TNM分期呈正相关,与性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤分化程度无明显相关性。生存曲线显示RLIP76的表达水平与患者预后(p<0.05)有明显相关性。结论:RLIP76与患者的淋巴结转移、TNM分期和肿瘤预后相关,提示RLIP76在胃癌的发生发展中发挥了重要作用。第二部分靶向敲除RLIP76,观察其对胃癌细胞生物学行为的影响目的:建立RLIP76低表达细胞模型并研究RLIP76对胃癌肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等生物学功能的影响及机制。方法:1.体外培养DH5α感受态细胞,胃腺癌细胞系SGC7901和MGC803细胞;2.病毒设计:Genebank基因序列检索查询RLIP76的基因序列,根据基因序列分别设计并合成寡聚单链DNA及一个Scramble序列,将寡聚单链DNA退火成双链,将双链的ShRNA oligo分别插入到ShRNA慢病毒载体中,构建ShRNA慢病毒重组质粒,并转化至感受态细胞DH5α。经病毒包装及病毒滴度测定后,构建pGMLV-SC5慢病毒介导的ShRNARLIP76,并加绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性双重标记。3.病毒转染:根据说明书提供的MOI(multiplicity of infection)值,将pGMLV-SC5慢病毒介导的ShRNA RLIP76和Scramble载体转染入胃癌肿瘤细胞系SGC7901和MGC803。用慢病毒介导的ShRNA载体转染胃癌细胞系SGC7901和MGC803,并在荧光显微镜下观察有绿色荧光细胞的比例和荧光强度。经过连续培养和嘌呤霉素筛选,获得转染成功的SGC7901和MGC803胃癌细胞系。4.病毒转染效率验证:通过qRT-PCR和western blot从mRNA水平和蛋白水平验证慢病毒介导的ShRNA RLIP76的敲除效率,筛选敲除效率最好的ShRNA序列。5.细胞功能学实验:通过克隆形成实验研究慢病毒介导的ShRNA RLIP76和Scramble转染后胃癌细胞系SGC7901和MGC803的集落形成能力;通过CCK8实验检测慢病毒介导的ShRNA RLIP76和Scramble转染后胃癌细胞系SGC7901和MGC803的增殖能力,并绘制增殖曲线;通过transwell实验检测慢病毒介导的ShRNA RLIP76和Scramble转染后胃癌细胞系SGC7901和MGC803迁移和侵袭能力改变;通过明胶酶谱验证细胞的迁移能力改变。通过Hoechst 33342染色实验研究慢病毒介导的ShRNA RLIP76和Scramble转染后胃癌细胞系SGC7901和MGC803凋亡水平的变化;通过Western blot研究RLIP76敲除后,相关的信号通路的变化,找到与RLIP76相关的信号通路分子。6.统计分析:通过GraphPad Prism 5统计软件进行数据分析,数值变量两个独立组分析用t检验。p<0.05认为有统计学意义。结果:1.筛选3个最优动力学参数的SiRNA序列,制备pGMLV-SC5慢病毒介导的ShRNA RLIP76载体:ShRNAl,ShRNA2和ShRNA3,并将慢病毒介导的Scramble序列作为阴性对照。荧光显微镜下观察绿色荧光后,pGMLV-SC5慢病毒介导的ShRNA载体的转染效率可达80%以上,细胞生长状态良好。2.qRT-PCR 结果显示 Sh-scramble、ShRNA1、ShRNA2 和 ShRNA3 转染后SGC7901细胞系中RLIP76 mRNA相对表达量分别为:0.947±0.038、0.246±0.021、0.706±0.109、0.361 ±0.093;转染空病毒、ShRNA1、ShRNA2和ShRNA3后,MGC803细胞系中RLIP76相对表达量分别为:0.973±0.061、0.225±0.009、0.469±0.050、0.377±0.061;ShRNA1 转染后 RLIP76 的敲除效率最高,相对于空病毒转染的细胞有明显的统计学差异(p<0.05)。3.Western blot 结果显示:SGC7901 转染 Sh-scramble、ShRNA1、ShRNA2和 ShRNA3 后 RLIP76 的相对表达量为:1.016±0.181、0.245±0.103、0.709±0.191、0.416±0.107。MGC803 转染 Sh-scramble、ShRNA1、ShRNA2和ShRNA3后RLIP76的相对表达量为:0.953±0.143、0.199±0.113、0.565±0.198、0.384±0.205。ShRNA1 转染后,SGC7901 和 MGC803 细胞中RLIP76蛋白表达量最少,相对于转染Scramble序列后RLIP76的表达量有统计学差异(p<0.05)。4.克隆形成结果示转染ShRNA1后胃癌细胞系(KD)SGC7901和MGC803的克隆数少于转染Scrambled ShRNA的胃癌细胞系(NC)。CCK8结果示转染ShRNA1后胃癌细胞系(KD)SGC7901和MGC803的增殖速度慢于转染Scrambled ShRNA的胃癌细胞系(NC)(p<0.05)。说明RLIP76敲除后对细胞的增殖有一定的抑制作用。5.Transwell迁移实验发现,转染ShRNA1后胃癌细胞系(KD)SGC7901的细胞迁移数为219.7±43.6,少于转染Scrambled ShRNA的SGC7901胃癌细胞系(NC):486.7± 128.8(p<0.05)。转染 ShRNA1 后胃癌细胞系(KD)MGC803 的细胞迁移数为 333.7±46.5,少于转染 Scrambled ShRNA 的 MGC803胃癌细胞系(NC):630±95(p<0.05)。Transwell侵袭实验中,转染ShRNA1后胃癌细胞系SGC7901的细胞(KD)穿膜数为97.7±24.3,少于转染Scrambled ShRNA的SGC7901胃癌细胞系(NC):306±33.5(p<0.05)。转染 ShRNA1 后胃癌细胞系(KD)MGC803的细胞穿膜数为163.3±87.5,少于转染Scrambled ShRNA的MGC803胃癌细胞系(NC):350±50.9(p<0.05)。明胶酶谱实验发现RLIP76敲除的细胞(KD)上清中MMP2降低。6.Hoechst 33342实验发现,转染ShRNA1后胃癌细胞系(KD)SGC7901和MGC803的细胞凋亡数量多于转染Scrambled ShRNA的胃癌细胞系(NC)(p<0.05)。Western blot实验中,转染ShRNA1后胃癌细胞系(KD)SGC7901 和 MGC803 中,凋亡蛋白 Bax、cleaved-PARP、cleaved-caspase-8 和cleaved-caspase-9表达量高于转染 scrambled ShRNA的胃癌细胞系(NC)。且Akt/mTOR信号通路在病毒转染后也发生了明显变化,转染ShRNA1后胃癌细胞系(KD)SGC7901和MGC803中,p-Akt和p-mTOR的表达量低于转染scrambled ShRNA 的胃癌细胞系(NC)(p<0.05),而 t-Akt 和 t-mTOR 的表达水平无明显变化。结论:1.靶向敲除RLIP76能够抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移。2.RLIP76敲除后,细胞凋亡增多,且与Akt/mTOR信号通路有关。第三部分RLIP76对VEGF分泌及体外血管形成的影响目的:研究RLIP76表达水平对VEGF分泌的影响,并明确RLIP76对血管生成的影响。方法:1.体外培养HUVEC细胞。2.在12孔板中培养转染ShRNA1和Scrambled ShRNA后胃癌细胞系SGC7901和MGC803,24小时后收集细胞上清。3.通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA)VEGF试剂盒检测收集的病毒转染后胃癌细胞系上清中的VEGF的含量。4.体外小管形成实验:在96孔板中加入预冷的Matrigel基质胶,并在37℃孵育1小时,将培养的HUVEC细胞与收集的转染病毒后的胃癌细胞系上清混合,将细胞混悬液加入铺有Matrigel基质胶的96孔板中并放在孵箱中孵育,2个小时后每隔半小时于显微镜下观察小管形成状况,并在8h时进行拍照。5.Western blot:通过免疫蛋白电泳验证慢病毒转染后细胞内VEGF的变化。结果:1.ELISA实验中发现,转染ShRNA1的胃癌细胞系(KD)SGC7901和MGC803培养24小时后细胞上清中VEGF的浓度分别为(pg/ml):158.582±6.931、264.024±11.177,转染 Scrambled ShRNA 的胃癌细胞系(NC)SGC7901和MGC803细胞上清中VEGF的浓度分别为465.048±2.121、463.453±13.350。转染 ShRNA1 的胃癌细胞系(KD)SGC7901 和 MGC803 培养24小时后细胞上清中VEGF的含量明显低于转染Scrambled ShRNA后胃癌细胞系(NC)上清中VEGF的含量(p<0.05)。2.小管形成实验发现,转染ShRNA1的胃癌细胞系(KD)SGC7901和MGC803培养24小时后收取的上清培养的HUVEC体外管型形成分别为:44.5±3.69、71.8±8.83(%control)(p<0.05)。转染 Scrambled ShRNA 的胃癌细胞系(NC)SGC7901和MGC803培养24小时后的细胞上清培养的HUVEC体外管型形成分别为 202.8±83.3、193±3.5(%control)(p<0.05)。3.Western blot发现,RLIP76敲除后,VEGF表达水平降低。SGC7901细胞中,NC细胞中VEGF的相对表达量为:1.351 ±0.107,KD细胞中的相对表达量为:0.553±0.071(p<0.05)。MGC803细胞中,NC细胞中VEGF的相对表达量为:1.230±0.230,KD细胞中的相对表达量为:0.823±0.191(p<0.05)。结论:RLIP76敲除后能够降低胃癌细胞VEGF的含量及分泌,并减少血管生成。