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LIM同源盒基因(LIM homeobox gene)家族成员之一的Lhx8与胚胎时期胆碱能神经元的发育有关,但是对于其在海马胆碱能神经再生中的作用及诱导其上调的机制尚未见有报道。本课题研究内容主要包括四个方面:1、切割穹窿海马伞后海马内Lhx8的表达变化及与Ch AT阳性神经元的共定位;2、过表达Lhx8促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化;3、沉默Lhx8抑制海马神经干细胞向胆碱能神经元分化;4、NGF上调Lhx8促进海马NSCs向胆碱能神经元分化的信号通路研究。一 目的观察切割穹窿海马伞后Lhx8蛋白表达的时相变化及与Ch AT的表达共定位情况,过表达和沉默Lhx8后对NSCs分化为胆碱能神经元的影响,明确Lhx8与海马胆碱能神经再生是否有关;探讨NGF上调Lhx8促进海马NSCs向胆碱能神经元分化的可能信号通路。二 方法(1)制备切割右侧穹窿海马伞大鼠模型,分别于术后第1d、3d、7d、14d、21d、28d检测Lhx8蛋白表达情况,并检测Lhx8蛋白表达量最高的第7d时Lhx8与Ch AT的共定位情况;(2)体外培养海马NSCs,并加入切割穹窿海马伞海马提取液,将Lenti6.3-Lhx8重组慢病毒转染至培养的细胞中,观察海马NSCs向胆碱能神经元分化情况,检测Lhx8和Ch AT的基因和蛋白表达变化;(3)将Lenti6.3-Lhx8重组慢病毒注入正常侧及切割穹窿海马伞侧大鼠海马齿状回中,观察海马齿状回中新生Ch AT阳性的胆碱能神经元的表达和定位,检测Lhx8和Ch AT的基因及蛋白的表达情况;(4)联合应用切割穹窿海马伞海马提取液及NGF培养海马NSCs,转染Lhx8干扰慢病毒,观察海马NSCs向胆碱能神经元分化情况,并检测Lhx8和Ch AT的基因和蛋白表达变化;(5)大鼠侧脑室灌注NGF提高海马Ch AT活性,将Lhx8干扰慢病毒分别注入正常侧及切割穹窿海马伞侧大鼠海马齿状回中,观察海马齿状回中新生Ch AT阳性的胆碱能神经元的表达和定位,检测Lhx8和Ch AT的基因及蛋白的表达情况;(6)应用NGF促进体外培养海马NSCs向胆碱能神经元分化,加入信号通路抑制剂,检测各通路中效应蛋白磷酸化水平、Lhx8基因和蛋白表达变化,观察使用信号通路抑制剂后海马NSCs向胆碱能神经元分化情况。三 结果(1)切割穹窿海马伞后随着时间延长,Lhx8蛋白的表达量逐步增高,且第7d时蛋白表达量达到高峰,此后逐渐下降。切割穹窿海马伞后第7天海马齿状回颗粒下层和门区中出现Lhx8阳性细胞,其数量和平均光密度明显高于正常侧,同时出现Lhx8/Ch AT双标阳性细胞;(2)海马NSCs转染Lenti6.3-Lhx8重组慢病毒后,分化为MAP2阳性神经元的数量没有明显增加,但能提高Ch AT阳性细胞占MAP2阳性神经元的比例,Lhx8和Ch AT的基因及蛋白的表达量也明显增高,说明上调Lhx8能够促进海马NSCs向胆碱能神经元分化;(3)重组慢病毒Lenti6.3-Lhx8能明显提高正常海马齿状回内新生的Ch AT/Lhx8阳性胆碱能神经元数量,将Lenti6.3-Lhx8重组慢病毒注射至切割穹窿海马伞海马齿状回中,发现新生的Lhx8阳性的胆碱能神经元的数量更多,Lhx8和Ch AT的基因及蛋白的表达量也明显增高,说明切割穹窿海马伞且上调Lhx8,可明显地促进海马内的胆碱能神经再生水平;(4)海马NSCs转染Lhx8干扰慢病毒后,分化为Ch AT阳性的胆碱能神经元占MAP2阳性神经元比例显著下调,Lhx8和Ch AT的基因及蛋白的表达量也明显降低,说明下调Lhx8能够影响培养的海马NSCs向胆碱能神经元分化;(5)切割穹窿海马伞并侧脑室灌注NGF后,将Lhx8干扰慢病毒注入海马,能明显降低海马齿状回中Ch AT/Lhx8阳性的胆碱能神经元数量,Lhx8和Ch AT的基因及蛋白的表达量也明显降低,说明下调Lhx8可抑制海马内NSCs向胆碱能神经元分化;(6)NGF作用于培养的海马NSCs后,AKT,IKB,NFκB,p38MAPK的磷酸化水平上调;给予相应信号通路抑制剂后,Lhx8的m RNA和蛋白表达水平下调,且以NFκB信号通路抑制剂BAY117082组下降最显著,联合应用各阻断剂并没有协同作用;给予NFκB信号通路阻断后显著影响海马NSCs向胆碱能神经元分化。四 结论(1)切割穹窿海马伞后Lhx8蛋白表达水平先上调后降低,7d时达高峰,且在海马齿状回颗粒下层和门区中出现Lhx8阳性的胆碱能神经元,推测Lhx8可能与海马的胆碱能神经再生有关;(2)过表达Lhx8不影响体外培养的海马源性NSCs向神经元分化,但能提高分化神经元中胆碱能神经元的比例。重组慢病毒Lenti6.3-Lhx8注入海马齿状回能促进切割穹窿海马伞后海马内的胆碱能神经再生;(3)Lhx8基因沉默后影响体外培养的海马源性NSCs向胆碱能神经元分化。使用NGF提高海马齿状回区域Ch AT活性,注入Lhx8干扰慢病毒能影响切割穹窿海马伞后海马内的胆碱能神经再生;(4)NGF可能主要通过NFκB信号通路上调Lhx8表达,促进海马NSCs向胆碱能神经元分化。