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食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)是一种原发于食管的恶性肿瘤,占食管癌90％以上,进行性吞咽困难为其典型的临床表现。ESCC具有高发病率、高死亡率和低检出率的二高一低特点,男性发病率高于女性。我国是ESCC发病率最高的国家之一,某些地区发病率高达130/10万。淋巴结非转移患者术后五年生存率为20％～30％,而转移患者术后五年生存率仅为13％,因此ESCC的早期诊断具有极大的临床意义。然而现有的ESCC检查手段包括食管脱落细胞学检查、X线检查、CT检查、内镜检查、超声内镜检查等无法实现早期诊断,临床上也没有ESCC特异的肿瘤标志物。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长度约为19～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA,与靶mRNA序列的3端非翻译区以碱基配对方式完全或不完全互补结合,抑制靶基因表达或促使靶基因降解。一些miRNA具有肿瘤组织特异性,其在肿瘤组织中的表达水平相对于正常组织发生了显著变化,与肿瘤密切相关,被称为“OncomiRNA”。最新研究发现,血清中也存在丰富、稳定的miRNA,在研究的几种癌症包括前列腺癌、结肠癌和胰腺癌等患者血清中miRNA表达谱呈现特异性变化,且这种变化可见于早期患者,提示血清miRNA可作为一种潜在的新型标志物,实现肿瘤的早期诊断。因此,我们推测ESCC患者血清中也存在其特异的miRNA表达谱,这种特异血清miRNA表达谱有可能成为一种ESCC早期诊断标志物。
目的:筛选出ESCC患者特异血清miRNA表达谱,评价其对ESCC诊断尤其是早期诊断价值。
方法:收集未经任何治疗的290例ESCC患者血清作为研究标本,同时收集140例年龄、性别匹配的正常人血清作对照。首先运用高通量、高灵敏度的Solexa测序技术对86例非转移、55例转移ESCC患者和40例正常人组成的三份混合血清中692种miRNA的表达量进行测定,初筛ESCC患者与正常人相比表达显著上调的miRNA。然后运用准确的实时荧光定量PCR技术(quantitiverealtimePCR,qRT-PCR)对初筛的miRNA在复筛组(36例ESCC和33例正常血清)中逐一测定,筛选出在患者血清中显著升高的miRNA。再运用qRT-PCR技术在验证组(113例ESCC和67例正常人)中验证,以获得在ESCC中稳定升高的一组血清miRNA。最后通过聚类分析和ROC曲线等评价其临床诊断价值。
结果:Solexa测序发现,ESCC非转移、转移患者和正常人血清中均存在丰富的miRNA(分别为315、268和316种),患者血清miRNA表达谱与正常人具有显著差异,其中25种miRNA在患者血清中表达量显著高于正常人(2倍以上)。通过qRT-PCR技术在复筛组中对该25种miRNA进行筛选发现,有7种miRNA包括:miR-10a,miR-22,miR-100,miR-148b,miR-223,miR-133a和miR-127-3p在患者血清中的表达量显著上升(变化倍数为1.65～2.97倍,p＜0.0001):复筛组结果得到了验证组进一步证实,7种miRNA上升仍然十分显著(变化倍数为1.69～2.57倍,p＜0.0001)。7种miRNA的ROC曲线下面积分别为miR-10a(AUC=0.79,95％CI=0.73～0.84),miR-22(AUC=0.82,95％CI=0.76～0.87),miR-100(AUC=0.75,95％CI=0.69～0.82),miR-148b(AUC=0.81,95％CI=0.76～0.86),miR-223(AUC=0.84,95％CI=0.79～0.89),miR-133a(AUC=0.72,95％CI=0.66～0.79),miR-127-3p(AUC=0.84,95％CI=0.79～0.89),明显高于传统肿瘤标志物癌胚抗原(AUC=0.549,95％CI=0.48～0.62)。根据给定的cutoff值,7种miRNA的灵敏性和特异性分别是:miR-10a为60％和84％,miR-22为62％和85％,miR-100为58％和80％,miR-148b为69％和80％,miR-223为70％和80％,miR-133a为50％和77％,miR-127-3p为72％和81％。聚类分析结果显示,7种miRNA的组合对复筛组患者和正常人正确划分率为77.8％和78.8％,对验证组患者和正常人正确划分率为77.9％和83.6％,对临床Ⅰ/Ⅱ期ESCC患者与正常人正确划分率为80.2％和80％。
结论:ESCC患者和正常人血清中存在丰富、稳定表达的miRNA,患者血清miRNA表达谱与正常人具有显著差异;ESCC患者血清中miR-10a,miR-22,miR-100,miR-148b,miR-223,miR-133a和miR-127-3p等7种miRNA的表达显著升高;上述7种miRNA的组合能够作为潜在的肿瘤标志物对ESCC进行诊断尤其是早期诊断。