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小反刍兽疫（Peste des petits ruminants,PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus,PPRV）引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病。PPR主要侵害绵羊、山羊等小反刍动物,以口炎、肺炎和发热为主要特征,该病严重阻碍了羊养殖业的发展。外泌体（exosomes）是一类介导细胞间通讯的纳米级囊泡,可通过其载荷的蛋白质、核酸、脂类等物质调节摄取这些外泌体的细胞的生物学活性。近年研究表明,外泌体介导的病毒逃逸或宿主免疫系统抑制可能是病毒传播以及致病的一条关键途径。我们的前期研究证明,PPRV感染引起山羊外周血单个核细胞（PBMCs）外泌体释放水平上升,提示外泌体在PPRV在细胞间传播中发挥作用。本研究旨在揭示PPRV感染诱导的外泌体在病毒传播中的作用及其机制,研究内容及结果如下:1. 将PPRV疫苗弱毒（N75/1株）感染非洲绿猴肾细胞（Vero）及山羊PBMCs后收集上清,通过低速离心除去死细胞、细胞成分和细胞碎片后,结合过滤技术除去游离的病毒粒子,超高速离心沉淀外泌体,最后用外泌体提取试剂盒富集纯化外泌体。通过纳米粒子追踪术（NTA）、透射电镜、Western blot技术鉴定提取的外泌体的纯度,NTA结果表明提取的囊泡在约100 nm处出现峰值,符合外泌体大小;透射电镜下观察到典型的茶托样囊泡形状;Western blot检测到外泌体标志蛋白CD63和CD81。以上结果表明分离出高纯度的山羊PBMCs和Vero细胞源外泌体。同时NTA、流式细胞术和Western blot检测结果均表明PPRV感染可诱导上述细胞外泌体分泌水平显著升高。2. PPRV感染Vero细胞后从上清中提取外泌体,与受体细胞（正常Vero细胞）共孵育72 h后,检测受体细胞中病毒增殖水平。激光共聚焦检测结果表明PPRV感染的对照细胞和与感染源外泌体共孵育的受体细胞中均可见大量PPRV阳染细胞;Western blot检测表明受体细胞中PPRV-N蛋白表达水平略低于PPRV感染对照细胞,但表达水平差异不显著;TCID50检测结果表明受体细胞中病毒滴度与PPRV感染对照组细胞中病毒滴度无显著差异。进一步用不同浓度GW4869（外泌体抑制剂）预处理细胞24 h后接种PPRV,48 h后提取外泌体并与受体细胞（正常细胞）共孵育72 h,Western blot和TCID50检测结果表明:随着GW4869浓度的升高,受体细胞中病毒复制水平和病毒滴度呈现递减的趋势。以上结果表明,PPRV感染细胞源外泌体可以荷载感染性病毒核酸在未感染细胞中建立增殖性感染。3. 鉴于病毒感染诱导的自噬与外泌体分泌之间的互作关系,本研究进一步检测PPRV诱导自噬对外泌体分泌水平的影响。利用自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin）处理细胞后,对自噬水平和外泌体分泌水平进行检测。Western blot检测结果表明,相较于对照组,雷帕霉素能够显著诱导细胞中自噬标志分子LC3-Ⅱ的表达水平以及培养上清液中外泌体标志分子CD63的表达水平;激光共聚焦和NTA检测同样明确了该结果。进一步将从PPRV感染且雷帕霉素处理的细胞培养上清中提取的外泌体与受体细胞（正常细胞）进行共培养,检测受体细胞中PPRV复制水平。结果表明:相较于PPRV感染对照组,PPRV感染且雷帕霉素处理增强了受体细胞中PPRV的复制水平。为了更加深入地分析PPRV感染后诱导的自噬对外泌体分泌的影响,将干扰自噬相关分子（ATG7和Beclin-1）的sh RNA转染细胞后接种PPRV,检测外泌体的分泌水平以及病毒的释放水平,结果表明通过干扰ATG7抑制自噬后,显著抑制了外泌体的分泌水平以及依赖于外泌体途径的病毒释放水平。4. 鉴于TSG101在外泌体分选荷载内容物中发挥重要作用,为确定TSG101在PPRV感染过程中对外泌体依赖性病毒释放途径的影响,首先将PPRV感染Vero细胞后检测细胞中TSG101蛋白的表达和外泌体分泌水平。Western blot和激光共聚焦检测结果表明:PPRV感染能够增强细胞中TSG101蛋白的表达。随后用干扰TSG101的si RNA或含有TSG101基因的质粒分别转染细胞后接种PPRV,检测外泌体分泌水平以及外泌体中PPRV核酸水平。结果显示干扰TSG101显著降低了外泌体中PPRV核酸水平,而过表达TSG101则增强了外泌体中PPRV核酸水平;另外,与敲降TSG101细胞源外泌体共培育的受体细胞中PPRV复制水平较对照组显著降低;相比于转染对照组,敲降或过表达TSG101均对外泌体分泌水平无显著影响。5. 为了进一步明确PPRV各蛋白分子在诱导自噬和外泌体分泌中的作用,分别用含有PPRV C、V、N、H、P、M基因的质粒转染细胞后,发现转染C-HA、H-HA和N-HA的质粒显著诱导了LC3-II的表达,同时促进TSG101以及CD63的表达水平。用表达荧光病毒蛋白的质粒（C-GFP、N-GFP和H-GFP）转染细胞,激光共聚焦检测到C蛋白、N蛋白和H蛋白均与TSG101存在共定位情况,并且Co-IP检测表明病毒的C蛋白、H蛋白和N蛋白均与TSG101存在互作。表明PPRV C蛋白、H蛋白和N蛋白通过上调TSG101和诱导自噬,进而在外泌体介导病毒在细胞间传播中发挥关键作用。综上所述,PPRV感染细胞源外泌体可以携带感染性PPRV核酸在受体细胞中建立增殖性感染,PPRV主要通过C蛋白、H蛋白和N蛋白分选PPRV感染性核酸装载入外泌体并促进外泌体释放。本研究揭示了外泌体在PPRV传播过程中的重要作用,以及细胞内源性TSG101和自噬在分选外泌体荷载物及分泌释放中的作用,为小反刍兽疫的防控提供新的思路。