恶性黑色素瘤是人类皮肤肿瘤中恶性程度最高的肿瘤之一,其死亡率占皮肤肿瘤患者死亡率的80%。黑色素瘤的恶性程度与线粒体异常的程度相关。已有实验证明将外源正常健康的线粒体输送至黑色瘤小鼠中,能够显著抑制黑色素瘤的增殖,并且从青年小鼠肝脏中提取出的线粒体抑制肿瘤的效果优于老年小鼠,然而其作用机制并不明确。此外,根据文献报道,雌性线粒体与雄性线粒体存在明显的区别。因此本研究在探究外源线粒体抑制肿瘤增殖的作用机制时,将线粒体分为雌性线粒体和雄性线粒体进行进一步的研究。在体外实验中,首先利用细胞免疫荧光证明外源线粒体能够进入B16细胞。其次,探究了雌性线粒体与雄性线粒体的差别,测定了两种线粒体的蛋白浓度、膜电位和丙酮酸脱氢酶的活性,发现雌性线粒体的丙酮酸脱氢酶活性更高。最后,通过阿尔玛蓝法检测和流式细胞仪检测探究了外源线粒体干预后,B16细胞增殖、凋亡及周期的变化,结果显示:在线粒体蛋白浓度为0-0.5μg/μL时,抑制细胞增殖呈剂量依赖性,且在0.4μg/μL时,浓度低,抑制效果好;线粒体组肿瘤细胞凋亡率增加、出现S期阻滞,且雌性线粒体组结果比雄性线粒体组更显著。由上述结果说明外源线粒体能够抑制肿瘤细胞增殖,促进凋亡的增加和阻滞周期,并且雌性线粒体抑制肿瘤增殖的效果强于雄性线粒体。在体内实验中,建立了两个肿瘤模型—原位皮下瘤和转移性肺瘤。在皮下瘤模型中,将外源线粒体通过尾静脉注射至皮下瘤模型小鼠中,从瘤体积、瘤重等来探究外源线粒体对皮下瘤的作用。结果显示:线粒体可显著性抑制黑色素瘤的快速增长,并且雌性线粒体抑制效果明显强于雄性线粒体。为了探究外源线粒体的作用机制,本实验检测与糖酵解相关的物质,包括丙酮酸激酶活性、乳酸含量和ATP含量,结果表明三者都显著降低,说明外源线粒体能够抑制糖酵解。从透射电镜观测中发现了肿瘤组织凋亡及自噬的增加,因此运用免疫印迹方法检测了与凋亡、自噬相关的蛋白,发现促凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达明显增加,且Mfn2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Parkin、PINK1也有增加的趋势。由上述结果说明外源线粒体能够促进肿瘤细胞的凋亡并能够增加自噬的产生。在小鼠转移性肺瘤模型,发现外源线粒体对肺转移瘤与皮下瘤具有相同的疗效。为了进一步探究外源线粒体抑制肿瘤的作用机制,利用转录组学筛选差异基因,发现外源线粒体能够显著抑制与细胞周期相关基因的表达。其中核基因FoxM1下调极为显著,其能够被线粒体-细胞核逆向调节信号ROS经由HIF-1α调控,由此推测外源线粒体通过ROS/HIF-1α/FoxM1来调控细胞周期。在差异基因功能分类中,还发现了多条代谢相关的通路与线粒体治疗的效果相关。因此通过高分辨质谱(HRMS)检测技术,筛选转移黑色素瘤小鼠注射外源线粒体后的差异代谢产物。结果显示,部分与脂类代谢和糖代谢相关的差异代谢物含量降低。脂类代谢与糖类代谢能够为肿瘤提供增殖所必需的物质。说明外源线粒体能够从抑制脂类代谢和糖代谢两个方面阻止肿瘤细胞增殖所必要的代谢物的生成;且通过对比雌性线粒体与雄性线粒体的差异代谢产物,发现雄性线粒体组和雌性线粒体组在一碳代谢中表现出明显的区别。本研究根据生化检测、转录组学和代谢组学等结果,揭示外源线粒体抑制转移性肺瘤的可能作用机制是外源线粒体进入肿瘤细胞后,通过降低ROS含量,继而促进HIF-1α降解,造成FoxM1基因表达下调,从而阻滞细胞周期和抑制肿瘤细胞的转移。并且其还能够通过抑制糖代谢和脂质代谢,致使肿瘤细胞增殖所需要的能量和脂肪酸不足,从而导致细胞增殖受到抑制并出现凋亡。而雌性线粒体抑制肿瘤效果优于雄性线粒体是因为雌性线粒体抑制一碳代谢的效果更好,从而抑制肿瘤增殖的效果更好。