蛋白质N-糖基化是常见的蛋白质翻译后修饰之一,在细胞粘附、识别、信号转导和免疫等各种生物学过程中发挥着重要的作用。然而,N-糖链本身其实也可以被多种官能团修饰,其中,磷酸和硫酸化修饰是两种最常见的负电荷修饰基团。硫酸化一般发生在复杂型N-糖链上,极少发生在高甘露型和杂合型糖链上。硫酸基团经常连接在半乳糖的第三位碳、N-乙酰葡萄糖胺的第六位碳、N-乙酰半乳糖胺的第四位碳和半乳糖-N-乙酰葡萄糖胺的第三位碳或第六位碳上。硫酸化糖链在细胞粘附、分子识别、控制癌细胞定向迁移和炎症免疫控制等生物过程中发挥着重要的作用,Ig G上的硫酸化N-糖链更是作为一种类风湿关节炎生物标志物被广泛研究。磷酸基团一般修饰在高甘露糖型的甘露糖的第六位碳上,因此被称为甘露糖-6-磷酸（M6P）。大多数M6P蛋白存在于溶酶体中,也被称为溶酶体水解酶,行使着水解各种化合物的功能。然而,水解酶的缺失和M6P依赖途径的异常都会导致溶酶体贮积疾病的发生。糖蛋白质组学的日益成熟使得磷酸化和硫酸化糖链的鉴定也得到了发展。但由于硫酸化和磷酸化糖肽在样品中的丰度远远低于多肽的丰度,而样品中带负电荷的多肽会对这两种糖链的鉴定信号造成干扰,因此高效的富集方法对于这两类糖链的鉴定十分关键。同时,这两类糖链的鉴定也要求质谱分析时选择合适的碎裂能量,以利于其特征离子的准确识别。通过合理利用不同碎裂能量及其组合,我们便能够实现硫酸化和磷酸化修饰的同时鉴定。本研究利用混合离子交换色谱柱（Mixed anion-exchange,MAX）来富集糖肽,排除了带负电荷多肽等的影响,随后利用固定金属亲和层析（Immobilized metal affinity chromatography,IMAC）中三价铁离子与带负电荷的磷酸、硫酸基团的静电作用特异地将这两种糖肽进行富集。新富集方法总共鉴定到778个硫酸化糖肽,250个硫酸化糖蛋白,相较于传统富集方法,鉴定数量分别提高了3倍和2倍。同时,新富集方法总共鉴定到271个磷酸化糖肽,111个磷酸化糖蛋白,相较于传统方法鉴定数量均提升了大约2倍。这些结果均表明了新富集方法在磷酸化、硫酸化糖肽和蛋白的富集和鉴定中的优越性。在硫酸化和磷酸化的鉴定分析中我们发现新富集方法所得到的结果与传统富集方法所得到的的结果交集较少,显示出两种方法对硫酸化和磷酸化糖肽不同的富集特点,将两者联用可以达到优势互补。两种方法联用后总共鉴定到981个硫酸化糖肽、333个硫酸化糖蛋白、317个M6P糖肽和137个M6P糖蛋白,使得鉴定到的硫酸化、磷酸化糖肽和糖蛋白的鉴定量达到最大化。此外,本研究利用质谱MS2下高能碰撞裂解（Higher energy collisional dissociation,HCD）对磷酸化和硫酸化糖肽在33%、20%和10%的碎裂能量下同时进行碎裂,可以实现磷酸化糖肽（HCD 33%和20%）和硫酸化糖肽（HCD 33%、20%和10%）的同时鉴定。综上所述,本研究建立了一种完整糖肽上硫酸化/磷酸化糖链同时鉴定的新方法,并解析了鼠脑组织中的磷酸化、硫酸化糖肽及其修饰蛋白的表达谱,为后续磷酸化、硫酸化糖蛋白的功能和病理研究提供了技术支持和数据基础。