目的:构建表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)的重组B组柯萨奇病毒株3型(coxsackievirus B3,CVB3),并评价pCVB3-eGFP基因组的稳定性,为报告基因在小RNA病毒研究中的应用提供参考。　　 方法:以peGFP-N1为模板PCR扩增eGFP基因序列,将扩增片段重组至CVB3基因组开放读码框(open reading frame,ORF)起始密码子下游用含重组病毒CVB3-eGFP的质粒转染HeLa细胞以恢复病毒,观察细胞病变(cytopathiceffect,CPE)及绿色荧光的表达。用噬斑实验纯化扩增病毒,收获第1～6代的CVB3-eGFP病毒液,并提取第2～6代病毒的RaNA进行RT-PCR,扩增出每代重组病毒基因组中eGFP及其周围的片段,并分析扩增产物的序列,以判断重组病毒基因组的稳定性。　　 结果:①构建了重组病毒pCVB3-eGFP,感染HeLa细胞可见明显细胞病变,病变细胞发绿色荧光。第6代重组病毒依然能够检测到eGFP的表达。②重组病毒pCVB3-eGFP从第2代起产生了缺失突变,丢失的基因包括eGFP基因及CVB3基因组自身的基因。③重组病毒基因组的丢失引起了CVB基因组开放读码框的移位、AUG密码子的丢失,进而导致死性突变。　　 结论:①重组病毒质粒pCVB3-eGFP可以用于CVB3感染的动态定量观察。②重组病毒CVB3-eGFP的基因组不稳定,在传代过程中会丢失报告基因及CVB3基因组的部分片段,产生缺失突变株病毒,并导致重组病毒的致死性突变。③要利用eGFP的表达准确评价CVB3病毒在体外或体内的感染,应尽可能选择二代以内的重组病毒,并利用噬斑形成实验筛选纯化病毒株,用到此病毒的实验资料要谨慎解释。