【摘 要】
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人源内皮抑素（human endostatin,h EDN）是一种理想的新生血管生成抑制剂,广泛应用于抗肿瘤血管生成的治疗研究中。目前利用微生物宿主制备h EDN主要是运用大肠杆菌表达系统,然而大部分都是以包涵体的形式表达。为高效制备h EDN,本文利用融合表达策略成功实现了h EDN的可溶性表达,并确定了最佳的发酵条件;进一步地,利用亲和层析和离子交换层析技术得到了较纯的h EDN融合蛋白;最后
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人源内皮抑素（human endostatin,h EDN）是一种理想的新生血管生成抑制剂,广泛应用于抗肿瘤血管生成的治疗研究中。目前利用微生物宿主制备h EDN主要是运用大肠杆菌表达系统,然而大部分都是以包涵体的形式表达。为高效制备h EDN,本文利用融合表达策略成功实现了h EDN的可溶性表达,并确定了最佳的发酵条件;进一步地,利用亲和层析和离子交换层析技术得到了较纯的h EDN融合蛋白;最后,通过细胞活性实验证实了h EDN能够抑制HUVEC细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞周期进程和迁移能力,为后续在医学方面的应用提供了理论参考。主要研究内容和结果如下:（1）h EDN重组表达菌株构建。优选了8个表达载体,分别构建了单基因表达质粒p ET28a-hedn,融合标签共表达质粒p TIG-hedn（含有Trx A标签）、p ETDuet-1-Trx A-hedn（含有Trx A标签）、p ETDuet-1-hedn-Trx A（含有Trx A标签）、p ETDuet-1-mbp-hedn（含有MBP标签）、p ETDuet-1-hedn-mbp（含有MBP标签）和融合表达质粒p ET32a-hedn（含有Trx A标签）、p GEX-6p-1-hedn（含有GST标签）。将重组菌进行摇瓶发酵,经过SDS-PAGE及MALDI-TOF/TOF串联飞行时间质谱鉴定分析h EDN表达情况。结果表明,仅有GST促溶标签的重组菌株E.coli BL21（DE3）/p GEX-6p-1-hedn能成功实现h EDN融合蛋白的可溶性表达。（2）h EDN可溶表达条件优化。为了提高h EDN融合蛋白表达量,依据E.coli BL21（DE3）/p GEX-6p-1-hedn重组菌株生长曲线,通过改变诱导温度、诱导时间、诱导剂IPTG浓度及添加诱导剂IPTG时间来优化h EDN融合蛋白的表达条件。经过SDS-PAGE分析最终确定h EDN融合蛋白的最佳发酵条件为20°C,8～12 h加入0.3mmol·L-1IPTG诱导36 h。（3）可溶性h EDN纯化。为了得到较纯的h EDN融合蛋白,分别采用了亲和层析和阳离子交换层析技术。首先经过Pre Pack GSH Purose 4 Fast Flow亲和层析初步纯化得到h EDN融合蛋白;其次选择Ni-NTA Purose 6 Fast Flow亲和层析进一步分离纯化h EDN;最后选择SP Purose 6 Fast Flow阳离子交换层析得到了较纯的h EDN融合蛋白。经重组Prescission Protease（PPase）酶切后得到相对分子质量约为22 k Da的目的条带,与h EDN理论分子质量相一致。（4）h EDN生物活性探究。分别考察了h EDN对细胞增殖、凋亡、周期和迁移能力的影响。首先采用CCK-8方法确定h EDN抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞增殖;其次通过Annexin V/PI染色法和流式细胞仪检测可知,h EDN促进HUVEC细胞凋亡;进一步地,基于流式检测细胞周期分布的情况可知,h EDN能够将细胞阻滞于G0/G1期进而延缓细胞周期进程;最后划痕实验结果表明h EDN抑制HUVEC的迁移能力。
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